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一、 实验原理

细胞黏附性是维持组织结构稳定的基本条件,也是细胞运动和发挥功能的调节因素,并且对细胞的增殖、分化有重要影响。通常可分为两类,即细胞与细胞黏附和细胞与基质黏附。机体内许多细胞,如上皮细胞,需要牢固地定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞黏附。细胞黏附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞在相互识别及黏附机制方面发生了改变。


二、应用简介

细胞粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs) 是一类膜表面糖蛋白,它们以配体-受体特异性结合的方式介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的相互接触和结合并调节细胞功能,在胚胎发育和分化、正常组织结构的维持、炎症反应、免疫应答、凝血和血栓形成、创伤修复、肿瘤浸润与转移等许多生理和病理过程中发挥重要的生物学作用。

细胞粘附实验通常分为两类,即细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。机体内许多细胞,如上皮细胞固定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。用到测定细胞粘附性的实验有:机械法测定细胞粘附性,发射性核素法测定细胞粘附性,细胞分离实验和肿瘤细胞聚集体形成实验。


三、 实验方法

1、将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。

2、培养24h后,用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞(两个平行孔,Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7),转染后的细胞置37℃、5%CO2培养箱培养,48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。 

3、培养48小时后收集细胞,用0.25%胰酶将贴壁培养细胞(约1×106个)从壁上消化下来并制成单细胞悬液。 

4、用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul(1:300)的人工基底膜胶备用。           

5、96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul,放于超净台中风干过夜。 

6、96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液(或PBS或生理盐水),放置60-90分钟,洗去多余的胶; 

7、取转染、阴性对照转染及不行转染的Hep3B细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中,设3个重复孔,放入37℃、5%CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。 

8、在相应时间点取出96孔板,吸出培养液,用PBS洗3遍,洗去未粘附细胞。

9、每孔加入100 ul甲醇,固定15min。 

10、每孔加入100 ul姬姆萨染液,染色15min,蒸馏水洗去染液。 

11、在200倍显微镜下计数粘附细胞数量(每孔在固定位置取8个视野)


四、样本送检要求


五、案例展示

 

六、常见问题

1、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小,重悬细胞是动作要轻柔,避免多次反复的激烈吹打,不用涡旋振荡器。

2、染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下,白细胞较难染色,因此需要较长的培养时间。培养时间一般为1- 4小时,但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察。

3、染色程度 (根据细胞种类而定,需要摸索一下条件)。当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔 (100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入染色液B。 

4、有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加染色液B试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。 OD值在0.4-2.0之间均可,最大值控制在1.0左右为宜,小于0.4或大于2.0请调整接种量和培养时间。 


七、服务流程

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