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科研服务


一、 实验原理

苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ),简称HE染色法 ,石蜡切片技术里常用的染色法之一 。

苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

①细胞核染色原理

苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

②细胞浆染色原理

细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染色,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

③分化作用

染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木精的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后,必须用0.5%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。

④返蓝作用

分化之后,苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水除去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。


二、应用简介

HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。常用于组织形态结构的观察。


三、实验方法


四、样本送检要求



五、 案例展示

 


六、 常见问题

1.切片染色不匀

1.1组织取材固定不当。

如组织取材过大或过厚,不能将组织完全固定,组织切片染色后出现外周固定好的部分易着色,而中间未固定好的组织,细胞着色模糊,使染色不均。在送检的标本中,及时用4%中性甲醛对标本固定,固定液应是标本的4倍。大标本应切开固定。

1.2切片薄厚不均或有横纹。

切片刀有缺口时,易造成断裂,破碎和不完整。切片刀倾角过大上卷,不能连在一起,过小则切片皱起。或因螺丝松动产生振动切片易造成厚薄不均或技术人员手臂摇动切片机头力量不均易造成横纹。切片时检查切片机螺母是否拧紧。

切片刀角度是否过大或过小即可。

1.3组织脱水,透明和浸腊处理不当

(1)组织脱水用的各级乙醇未能保证相应浓度使组织脱水不彻底

(2)二甲苯内的时间过长组织易碎也无法切出好片子。

(3)浸腊温度过高,组织变脆也不利切片染色。

1.4染色过程处理不当

(1)组织切片脱腊不彻底,如二甲苯时间过久 ,无水乙醇不纯或时间过久,室温低,组织切片上的石蜡没有全部除掉时,含腊部分不着色或着色过浅染色液试剂量少,组织切片没有全部浸到 。

(2)组织切片上在捞片时有气泡,则气泡内组织可能染色不均。

2.切片染色模糊不清

2.1取材:

组织标本已发生自溶或取材后没及时固定或固定液浓度不够;另固定前干枯标本,染色后易出现灰染现象,很难补救。

2.2固定

(1)固定剂对组织有一定媒染作用,它既可与蛋白结合又能与染料结合,可增强着色能力,同时能沉淀和凝固细胞内成分,使细胞内成分产生不同折光率造成光学差异。故固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因

(2)在日常病理制片中淋巴结处理不当造成切片染色后组织见发灰现象,其主要原因由于细胞密集,结构复杂导致固定液难以渗透到组织深部,从而造成组织中央固定不佳,而出现彻底发灰现象。可用等量无水乙醇乙醚混合液处理切片5-10分钟,乙醇洗,水洗,3%硫酸铁铵溶液补充媒染5分钟既可。

(3)送检标本部分用乙醇固定组织,常温下乙醇的白蛋白,球蛋白不再溶于水,而核蛋白则可溶于水。故乙醇固定标本切片,切片染色不良,细胞质染色较差。切片出现模糊不清现象,其补救办法液4%中性甲醛对标本再固定。

3.其他原因

3.1温度:

包埋/切片后烤片温度过高,均会使蛋白发生质变可能发生拒染,造成切片染色模糊不清。

3.2染料:

质量差或溶液配制不当,如配制苏木精时加热使氧化过度,不能生成三氧化苏木红生成四氧化苏木红使染液没有染色能力或苏木精使用时间过久,导致切片着色能力或苏木精使用时间过久,导致切片着色不良,切片模糊不清。

3.3分化过度 细胞核着色淡

3.4脱水

透明不彻底:切片如在二甲苯中有白雾现象发生即表示乙醇脱水未尽,应立即返回重新脱水。否则,镜下组织结构模糊不清。

3.5封固

(1)注意避免封片者口鼻呼出气接触组织上封剂。

  因呼出气体中会含水分;

(2)在潮湿环境中动作要快,以免空气水进入封固内响质量。


七、服务流程


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