针刺对Ⅳ型变态反应模型豚鼠干预作用的研究

作者                                          作者单位

谢长才                  广州中医药大学第二附属医院针灸科,广东广州;广州中医药大学,广东广州

许能贵                  广州中医药大学第二附属医院针灸科,广东广州;广州中医药大学,广东广州

符文彬                  广州中医药大学第二附属医院针灸科,广东广州;广州中医药大学,广东广州

孙健                    广州中医药大学第二附属医院针灸科,广东广州;广州中医药大学,广东广州

Ⅳ型变态反应是由细胞介导的迟发性超敏反应所致的皮肤病，是常见的变应性炎症性皮肤病。其中最常见的有慢性湿疹和变态反应性接触性皮炎，临床特点表现为剧烈瘙痒，有多形性皮疹及渗出倾向，易于复发并趋向慢性化[1]。临床研究证实针灸治疗Ⅳ型变态反应性皮肤病，具有抗炎、止痒、调节机体免疫功能的作用[2]。本实验观察了针刺对Ⅳ型变态反应模型豚鼠的影响，为临床提供针刺治疗Ⅳ型变态反应的理论依据，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1动物及分组

普通级雄性白化豚鼠，体质量250～300g，由广州中医药大学实验动物中心提供。合格证编号：0021021，0025124。按随机数字表法将36只豚鼠分为3组，即空白组、模型组、针刺组。空白组不给予任何处理，模型组除造模外不给予任何处理。

1.2主要试剂与仪器

2，4二硝基氯苯(DNCB)由中国上海华强试剂有限公司提供，批号20070103;68052型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂生产);华佗牌28号1寸毫针(苏州医疗用品厂出产);6mm圆形打孔器、分析天平、轮转式切片机、染色机、脱水机、电热恒温干燥箱、光学显微镜及显微摄像系统等器材均由广州中医药大学针灸推拿学院中心实验室及第一附属医院病理室提供。

1.3模型复制豚鼠造模方法

参照Boyera[3]及王国江等[4]的报道。首先于豚鼠颈背部剪毛，面积2cm×2cm大小，50mg/L 24二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液50 μL外涂致敏;2周后豚鼠左耳内侧涂1mg/L DNCB丙酮溶液100 μL作为激发，每周1次，连续4周;第4次激发后72 h将豚鼠随机分组处理。

1.4治疗方法

针刺组在慢性湿疹造模完成后，根据《实验针灸学》[5]取曲池(双)、血海(双)，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。用1寸毫针刺入所选穴位，将针柄分别连接至电针治疗仪的电极上，疏密波进行治疗，5～10次/s，以豚鼠能安静耐受为宜。每天针刺1次，每次20min，治疗5d后间隔1d，继续治疗5d，共治疗10次为1个疗程，完成后取材。

1.5观察指标

1.5.1耳厚度及耳质量于激发后72h以直径5mm的金属打孔器于左耳部造模处取组织块，同时右耳相同部位打孔，测量所取耳部厚度，同时用电子天平称取左右耳组织块质量，计算激发后左右耳厚度差及左右耳质量差。

1.5.2中性与嗜酸性粒细胞及单核细胞与淋巴细胞计数将各组左耳组织块制成常规苏木素—伊红(HE)染色切片，在光镜下用网形目镜测微尺细胞数，以单盲法计数每mm2中性与嗜酸性粒细胞数及单核细胞与淋巴细胞数。判断标准(每mm2炎症细胞数)：(-)为真皮内无单核细胞、淋巴细胞及中性与嗜酸性粒细胞;(+)为单核细胞或淋巴细胞及中性与嗜酸性粒细胞10个左右;(++)为单核细胞或淋巴细胞及中性与嗜酸性粒细胞20个左右;(+++)为单核细胞或淋巴细胞及中性与嗜酸性粒细胞30个左右。

1.5.3病理观察光镜下观察治疗后各组豚鼠耳切片的病理变化。

1.6统计学方法

采用SPSS100统计软件进行数据分析，两样本均数比较采用t检验、秩和检验，组间两两比较采用q检验。

2结果

2.1各组耳厚度及质量比较

表1及表2结果显示,模型组耳厚度和质量与空白组比较差异有显著性意义(P<001)，说明本实验造模成功。针刺组与模型组比较，在对豚鼠耳厚度和耳质量的影响上差异均有显著性意义(P<005)。表1各组对豚鼠耳厚度的影响(略)表2各组对豚鼠耳质量的影响(略)

2.2各组豚鼠真皮内炎症细胞数比较

表3结果显示，模型组与空白组单核细胞与淋巴细胞数、中性与嗜酸性粒细胞数比较差异有显著性意义(均P<005)，说明慢性湿疹模型造模成功。针刺组可一定程度降低炎症细胞数，但与模型组比较无显著性差异(P>005)。

表3各组豚鼠真皮内炎症细胞数的影响(略)

2.3病理切片观察结果

空白组皮肤表皮、真皮、软骨均未见明显病变(图1-a，彩图见第199页)。模型组皮肤表皮增生，棘层明显增厚，角化过度及角化不全，表皮内有轻度细胞间水肿，表皮突显著延长，真皮上部中度血管周围炎性浸润，以淋巴细胞居多，间有嗜中性粒细胞及纤维细胞，呈慢性湿疹病理改变(图1-b，彩图见第199页)。针刺组皮肤表皮轻度增生，棘层轻度增厚，与模型组比较程度减轻，真皮上部中度血管周围炎性浸润，可见散在淋巴细胞，单核细胞、嗜中性粒细胞及纤维细胞浸润，与模型组比较数量明显减少(图1-c，彩图见第199页)。3讨论Ⅳ型变态反应性皮肤病的治疗目前主要采用抗组胺类药物和皮质类固醇激素治疗，疗效不令人满意，且皮质类固醇激素治疗又有一定副作用，停药后反跳现象明显，而中医药治疗已取得良好的疗效。为进一步寻找和筛选一些有疗效的治疗方法，发挥中医药治疗Ⅳ型变态反应的优势，我们从针灸学治疗角度在Ⅳ型变态反应的实验研究方面寻找理论上的依据。本实验采用24二硝基氯苯(DNCB)反复激发豚鼠方法复制慢性湿疹样改变。豚鼠的皮肤最易致敏，适于用作过敏反应的研究，特别是迟发型超敏反应更接近人类慢性变应性湿疹的病理学改变[6]。尽管该模型造模时间较长,而且用小鼠复制成慢性皮炎—湿疹模型的技术也较为成熟,但由于运用针刺技术于豚鼠来说更方便，更具于实验效果的准确性，所以我们选择豚鼠慢性接触过敏反应模型。本实验中针刺选择的基本穴位为曲池、血海两穴。曲池穴有祛邪透表和驱逐周身风邪的特殊作用，主治皮肤病、外感表热证，既能解肌又能宣肺，对互为表里的肺经和大肠经都具有调节作用，是临床治疗皮肤病的首选穴位。血海是足太阴脾经穴，别名百虫窠、血郄，为阴血之海，故而得名，具有养血行血、凉血调血之功，下半身之血证和血虚、血燥、热耗阴血所出现的皮肤病及同血分、湿气有关的皮肤病均属本穴的主治范围。古人云：“治风先治血，血行风自灭”，故选血海以行气活血，和营解表。同时曲池、血海两穴为消疹止痒之常用穴，常用以治疗瘙痒性皮肤病，故用此两穴相配可使营卫调和，风热得解，从而达到标本并治之功。在实验中，豚鼠耳厚度及质量差可说明其炎症反应的程度，针刺对炎症反应的抑制强度表现为差值越小，抗炎作用越强。在真皮内炎症细胞数的影响上表现出一定的抗炎作用。在皮损病理切片观察研究中发现模型豚鼠出现慢性湿疹局部浸润、脱屑充血、角化不全、角化过度等，真皮上部中度血管周围炎症浸润，其中散在淋巴细胞，单核细胞、嗜中性粒细胞及纤维细胞浸润，与模型组比较针刺组细胞数量明显减少，针刺对豚鼠慢性湿疹炎症的改变有较好的疗效，显示针刺具有一定的抗Ⅳ型变态反应的作用。前期研究结果显示针刺处理能调整Th1/Th2细胞因子的平衡，对细胞免疫作用明显[7]。但针刺抗IV型变态反应的作用机制有待进一步深入研究。

【参考文献】

[1]朱仁康.中医外科学[M].北京：人民卫生出版社，1987：724-727.

[2]徐永平，王英高.穴位注射治疗手掌湿疹的疗效观察[J].中国针灸，2004，24(10)：695.

[3]Boyera N，Caver D，Bouclier M，et al.Repeated application of dinitrochlorobenzene to the ears of sensitized guinea pigs：A preliminary characterization of a potential new animal model for contact eczma in humans [J].Skin Pharmacol，1992，5(3): 185.

[4]王国江，顾军.小鼠背部变应性接触性皮炎模型的建立[J].中国职业医学，2004，31(1)：17.

[5]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：329.

[6]邬成霖，罗维丹，寇霄，等.中药复方除湿汤治疗慢性湿疹的实验研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2004,4(3)：220.

[7]谢长才，许能贵，杜亦旭，等.针刺对Ⅳ型变态反应豚鼠模型Th1/Th2细胞因子平衡的影响[J].新中医，2008，40(5)：95.