蒙药那仁满都拉多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

　　蒙成药那仁满都拉由石榴、白豆寇、革羡、黄精、玉竹、天门冬、天花粉、羡黎、肉桂、红花、冬葵果11种单药炮制而成，临床上常用来治疗胃寒、消化不良、浮肿、肾寒、腰痛、遗精淋下、寒性腹泻，具有补肾、消食、补虚、抗疲劳、健身的功效川。蒙药在消除疲劳、改善运动能力的理论和实践中具有独特的优势和潜力。使用纯天然药物治疗疾病极具发展前景，已经成为国内外重要的研究课题。多糖作为一类重要的生物活性物质，在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等疑难病症的治疗方面得到了广泛的应用。本文从蒙成药那仁满都拉中提取多糖，经过脱蛋白、脱色、透析、柱层析等方法进行纯化，并用分光光度法测定了多糖对活性氧的清除作用及对脂质过氧化物的抑制作用，为该药在临床中的广泛应用提供理论依据和数据参考。　　1 仪器、材料与试剂　　层析柱(600mmx16mm)、透析袋(北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司，进口分装，36DM)、高速离心机(上海安亭科学仪器厂，TDL一5)、UV一240型分光光度计旧本岛津)、NICOLET5700FT一IR红外光谱分析仪(美国Pekin一elme:公司)、722s型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。　　蒙成药那仁满都拉，由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供。实验动物为昆明小白鼠，清洁级，体重(20士2)g，由内蒙古民族大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK一(吉)2007一0003}DE-AE一Cellulose,SephdexG一100、三经甲基氨基甲烷、氯化硝基四氮哩兰NBT、硫代巴比妥酸均为生化试剂，Sigma公司;番红花红叭只氯甲烷、正丁醇、氨水、过氧化氢,a一蔡酚、苟三酮、碘、碘化钾为国产分析纯。对照品苯甲酸、甘露醇和维生素C(抗坏血酸)分别购于上海汕头光华化学试剂有限公司和天津市光复精细化工研究所(GC,GC和HPLC法测得纯度分别为)99.9%,99.0%,99.99%)，均为优(超)级纯，实验用水为重蒸水。　　2 实验方法　　2.1 粗多糖的提取 将药品粉碎过60目筛，分别取10.0,20.0,20.0g，精密称定，置于3个圆底烧瓶中，分别加水100,200,200mL，在75一800C回流3h，每次3h，抽滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，减压浓缩至40一50mL。加浓缩液体积2倍的无水乙醇，醇沉静置24h，抽滤，用乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，干燥，备用。　　2.2粗多糖含量测定以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，通过硫酸一苯酚法测定粗多糖含量。　　2.3粗多糖的定性分析　　2.3.1苟三酮反应取荀三酮O.lOg，溶解于5mL95%乙醇中配制荀三酮溶液。称取多糖0.005g溶解于5.0mL水中配制1.0mol·L多糖溶液。取多糖溶液1.0mL，加人茹三酮溶液0.5mL,混合均匀后于沸水中加热10min，观察现象。多糖溶液与苟三酮反应成阳性，说明含有蛋白质。　　2.3.2碘一碘化钾反应称取碘化钾2.0g，溶于10.0mL水中，加碘1.0g溶解后加水290mL，配制碘一碘化钾溶液，保存在棕色瓶中备用。取浓度为1.0mol·L多糖溶液1.0mL于试管中，加碘一碘化钾试剂2滴观察溶液颜色的变化，溶液颜色无变化，说明不含淀粉。　　2.3.3MoLish反应称取。蔡酚0.1g溶解于2.0mL水中配制MoLish试剂。取多糖溶液1.0mL于试管中，加MoLish试剂2滴振荡均匀，沿试管壁加浓硫酸1.0mL，放置观察两液面交界处的颜色变化，若有紫色出现，说明含有多糖类物质。　　2.4多糖的纯化　　2.4.1Sevag。法除蛋白质}s}量取氯仿80.0mL,正丁醇20.0mL混合配制成Sevage试剂。取粗多糖溶于适量水中，加人1/5糖溶液体积的Sevage试剂，用玻璃棒搅拌10min，离心(4000:·min)10min，除去蛋白层，取_[层清液重复操作至茹三酮反应呈阴性。　　2.4.2HZOZ脱色向已脱蛋白的多糖溶液中加人氨水至溶液的pH为8一9，然后按溶液体积的1/5加巧%的双氧水，在50℃水浴中保温1h，置于阴凉处放置24h，抽滤，弃去沉淀，将滤液浓缩，加浓缩液体积2倍的乙醇醇沉24h，抽滤，用乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，干燥，备用。　　2.4.3透析将脱色的多糖，加水溶解置于800C水浴中溶解，抽滤，弃去不溶性沉淀，将溶液转人截流范围为8000一14000的透析袋中密封，置于水中透析24h，每隔4h换一次水，将透析液浓缩，加溶液体积2倍乙醇醇沉24h，抽滤，用乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，干燥，备用。　　2.4.4柱层析[6]取上述处理后的多糖，溶于水中，备用。用2一3倍体积的洗脱液(0.1mol·L氯化钠溶液)平衡凝胶柱，流速为0.5mL·min，然后用2倍体积的水平衡。将多糖溶液沿层析柱管壁小心加人，流速0.5mL·min，用0.1mol·L氯化钠溶液洗脱，用硫酸一苯酚法测定多糖含量。以管数为横坐标，吸光值为纵坐标作图。收集合并主糖峰的洗脱液，浓缩、醇沉、洗涤、干燥得白色粉末状多糖NPl，继续以SephadexG一100凝胶柱纯化后得NP1纯品。　　2.5多糖的抗氧化活性　　2.5.1试液的配制精确称取干燥的NPl、维生素C、甘露醇各0.007,0.016,0.025,0.034,0.043,0.052g,分别置2SmL量瓶中，加重蒸水溶解、稀释至刻度，配制成浓度分别为0.28,0.64,1.00,1.36,1.82,2.08mg·mL的试液备用;精确称取苯甲酸0.008,0.0125,0.017,0.0215,0.026g，分别置2SmI量瓶中，加重蒸水溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为0.32,0.S0,0.68,0.86,1.04mg·mL一’的试液备用。　　2.5.2多糖对·OH的清除作用}5;·OH由ED-TA一Na一Fe(11)一HZOZ体系产生，实验按参考文献所述方法进行。以苯甲酸、维生素C和甘露醇做阳性对照品。实验结果以清除率(E,'`lo)表示，按公式E(%)二(A试液一A、白)/A试液x100%进行计算。　　2.5.3多糖对·O2的清除作用，邻苯三酚在碱性条件下易氧化产生超氧阴离子自由基，与NBT作用形成紫色化合物，吸光度反映的含量。加人不同浓度试液，测定样品对吸光度的影响。　　实验按参考文献所述方法进行以苯甲酸、维生素C和甘露醇做阳性对照品。测定结果以清除率表示:E（%)=A空白一A试液)/A空白x100%。　　2.5.4多糖对脂质过氧化的抑制作用9三肝组织匀浆液的制备:取新鲜的小鼠肝组织用冰冷的生理盐水漂洗，滤纸吸干称质量，冰浴下匀浆，制成10%的悬浮液。3000一4000:·min一’离心15min,_L清液即为肝组织匀浆液}m70·OH由EDTA一Nay-Fe(II)一HzOz体系产生，使肝匀浆中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，其终产物为丙二醛(MDA)，在HAc条件下，TBA可使MDA显色，根据显色程度衡量MDA的相对含量。采用TBA显色法，反应体系为10%的肝组织匀浆液0.5mL,pH7.4磷酸盐缓冲液1.0mL,EDTA一Naz一Fe(II)Z.0mL,3%过氧化氢溶液1.0mL，不同浓度试液10mL;空白液以等体积重蒸水代替样品液。各组反应液混合均匀后于37℃水浴加热30min，取出后冷却至室温，各取0.3mL于小试管中，加人5%的TBA0.6m[和}0%冰醋酸1.2mL，在95℃水浴中加热1h，冷却至室温，在530nm处测其吸光度，测定结果以计算抑制率表示:E(%)=(A空白一A试液)/A空白x100%。　　3结果与讨论　　3.1多糖含量以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线(r=0.9988)，根据标准曲线计算得粗多糖含量为61.9%，经纯化后多糖(主要成分NPl)的含量为91.7%。　　3.2多糖的化学定性分析从多糖的定性分析可知，粗多糖中含有蛋白质，但不含淀粉。通过脱色、脱蛋白、透析、柱层析等方法进行纯化后，经苟三酮反应表明多糖中已不含蛋白质}4}03.3多糖的分离纯化粗多糖用DEAE一Ce11u1ose柱进行分离，用Q.1mol}L-'氯化钠溶液洗脱，洗脱曲线见图1，由图1可知粗多糖进行柱层析分离可得其主要组分为NPI。　　3.4多糖的抗氧化活性分析　　3.4.1多糖对·OH的清除能力以苯甲酸、维生素C和甘露醇做阳性对照，测定了NP1对·OH的清除能力，结果见图3。由图3可知，苯甲酸的清除·OH能力最强，NP1次之，即NPl对·OH的清除能力弱于苯甲酸，但强于维生素C和甘露醇。苯甲酸、维生素C和甘露醇的清除能力随着浓度的增大呈增强趋势，但NP1当达到一定浓度时其清除能力呈平稳趋势。　　3.4.2多糖对·0歹的清除能力以苯甲酸、维生素C和甘露醇做阳性对照，测定了NP1对的清除能力，结果见图4。由图4可知，NP1对·O2的清除能力弱于苯甲酸和维生素C，但强于甘露醇。四者的清除能力随着浓度的增大都有增强趋势。　　3.4.3多糖对脂质过氧化的抑制作用由表1中数据可知，NP1在低浓度(0.64mg·mL)时对脂质过氧化没有抑制作用，当达到一定浓度(1.36mg·mL)时抑制作用最强，其后又呈减弱趋势。因此可以判断NP1对脂质过氧化的终产物MDA的抑制作用并不是随着浓度的增大而增大的。　　实验结果表明，NP1的分子结构中存在月一糖普键，这是其对自由基具有较强清除能力的根本原因，还可得知多糖对经自由基、超氧阴离子自由基的清除能力不尽相同，同浓度的多糖对·OH的清除能力更强。对脂质过氧化的终产物MDA的抑制作用呈先增大后减小的趋势，鉴于这样的实验结果，未对苯甲酸、维生素G、甘露醇等对照品进行实验。　　参考文献1 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