黄连素对胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

黄连素是一种传统中草药，以前主要用于消化系统肠道炎性反应。随着对黄连素临床研究的深入，不断发现它在其他疾病的作用，它具有抗心律失常、降血压、血脂、血糖等作用，近年来，还发现它具有抗肿瘤的作用。本研究通过用黄连素与人胰腺癌Panc-1细胞共同培养,用MTT法检测细胞增殖抑制率,用流式细胞仪检测人胰腺癌Panc-1细胞凋亡及免疫组化检测Caspase-3蛋白的表达,以探讨黄连素对人胰腺癌Panc-1细胞的作用及其可能机制。

通讯作者：罗汝耿1资料与方法

1.1实验材料：人胰腺癌Panc-1细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心)，黄连素(陕西永嘉天然植物开发有限公司)，PI(碘化丙啶)、胰蛋白酶、DMSO、MTT(Sigma公司),Annexin V凋亡试剂盒(碧云天生物公司)，鼠抗人Caspase-3 (R&D SYSTEMS)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养：人胰腺癌Panc-1细胞培养于含有10%灭活的胎牛血清、100 IU/ml 青霉素和100 μg/ ml 链霉素的DMEM完全培养基中，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育。待细胞生长铺满培养瓶底约80%消化传代一次。

1.2.2细胞增殖抑制率检测：用10%胎牛血清的DMEM使细胞浓度为5×108/L,细胞接种于96孔板,每孔体积为200 μl。细胞在贴壁生长后吸去培养基,每4孔为1个单位,再加入含有黄连素终浓度分别为0 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L的培养液200 μl继续培养12 h、24 h、48 h、72 h。每孔加入MTT溶液温育4 h，用酶标仪测定波长在490nm的吸光度值。计算增殖抑制率。公式：增殖抑制率=(1-试验组A490值/对照组A490值)×100%。

1.2.3Annexin V和PI双染法分析细胞凋亡：将细胞以5×108/L的密度接种在培养瓶中,药物浓度分别为0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L作用48 h后,收集贴壁细胞,制成0.5 ml PBS单细胞悬液,先后加入Annexin V和PI各5μl,室温下避光染色10 min。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4免疫组化检测胰腺癌细胞的Caspase-3蛋白的表达：72 h细胞爬片后,用SP法检测,结果判定标准：每组设阳性对照(黄连素处理组)和阴性对照(PBS液代替一抗组),见胞质有黄色颗粒着色为阳性。结果判断:细胞染成黄色为Caspase-3阳性,依染色深浅分为：-(未染色)、+ (弱)、++(中)、+++(强),计分值为：0(-)、1(+)、2(++ )、3(+++)。每份样本计数200个细胞,算出各个染色细胞的累积分值计分。

1.3统计学分析：应用SPSS17.0统计软件分析，实验结果以均数±标准差(x±s)表示。多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane′s T2 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2结果

2.1黄连素对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响：应用MTT法检测黄连素作用后各组胰腺癌Panc-1细胞的增殖能力。结果显示黄连素作用于胰腺癌Panc-1细胞24 h后,在25~200 μmol/L浓度范围内对胰腺癌Panc-1细胞的增殖均有抑制作用,且药物浓度越高、作用时间越长,其抑制作用越强,呈现明显的剂量时间依赖关系。见表1。

表1MTT法检测胰腺癌Panc-1细胞增殖抑制率(x±s，%)

浓度(μmol/L)24 h48 h72 h255.19±0.567.89±0.42②32.05±2.79②5015.27±1.35①41.63±3.73①②59.91±3.76①②10040.28±2.61①62.49±3.29①②80.63±3.57①②20060.21±3.38①82.91±3.12①②91.44±3.39①②注：与25 μmol/L组比较，①P<0.05;与24 h比较，②P<0.05

2.2黄连素对胰腺癌Panc-1细胞凋亡的影响：应用流式细胞仪检测黄连素作用48 h后各组胰腺癌Panc-1细胞的凋亡率。结果显示，在加入黄连素前，胰腺癌细胞几乎没有检测到细胞凋亡(0.89±0.21)%，加入黄连素后，胰腺癌细胞凋亡率开始升高。黄连素浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的胰腺癌细胞凋亡率分别为：(4.25±0.47)% (8.38±1.23)%、(13.52±1.59)%、(18.79±2.27)%。可见，随着黄连素的浓度增加，胰腺癌细胞凋亡率逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3黄连素对胰腺癌Panc-1细胞Caspase-3蛋白表达的影响：应用免疫组化检测胰腺癌细胞的Caspase-3蛋白的表达。黄连素浓度为0 μmol/L、 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的胰腺癌细胞Caspase-3蛋白分值分别为：(9.84±0.79)分、(21.47±2.15)分、(35.45±4.23)分、(63.97±6.34)分、(98.26±8.87)分。结果显示，黄连素作用72 h后胰腺癌Panc-1细胞Caspase-3蛋白的分值与对照组比较明显增加，而随着黄连素的浓度增加，Caspase-3蛋白在胰腺癌Panc-1细胞中的表达愈加明显，呈浓度依赖关系，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

胰腺癌是一种恶性程度非常高的消化道肿瘤，由于其隐匿性强、侵袭转移快，故早期诊断难，预后极差,死亡率高[1]。临床上多数患者就诊时已经失去手术治疗机会，只能行化疗等姑息辅助治疗。黄连素是一种新近发现具有抗肿瘤作用的药物，它又叫盐酸小蘖碱,是从黄连、黄柏、三棵针等毛莨科黄连植物根状茎中提取的生物碱,也可以用人工方法合成。

国外已经有研究证实黄连素对结肠腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、白血病、脑部肿瘤、淋巴瘤的生长有抑制作用[2-5]。而对较常见的消化道肿瘤胰腺癌还没有相关研究。本实验通过选用不同浓度的黄连素与胰腺癌细胞培养，发现黄连素对人胰腺癌Panc-1细胞的增殖均有抑制作用，且药物浓度越高、作用时间越长,其抑制作用越强,呈现明显的时间-剂量依赖关系。而且通过流式细胞仪检测结果显示，黄连素作用后，胰腺癌细胞凋亡率开始升高。随着黄连素的浓度增加，胰腺癌细胞凋亡率逐渐升高。说明黄连素能诱导胰腺癌细胞的凋亡。那么黄连素是通过什么途径来诱导细胞凋亡的呢?细胞凋亡受到相关基因和蛋白的严格调控，正常细胞半胱氨酸蛋白酶Caspase的表达是非活化的酶原状态，一旦开始启动凋亡程序，Caspase被激活，随后不可逆的发生凋亡蛋白酶的层叠性级联反应。而Caspase-3在凋亡过程中是效应器酶，起到了非常关键作用[6]。笔者通过免疫组化检测胰腺癌细胞的Caspase-3蛋白的表达，发现用黄连素处理过的胰腺癌细胞中的Caspase-3蛋白表达水平随药物浓度增加有明显提高，说明黄连素可能通过增加Caspase-3蛋白的表达来增强胰腺癌细胞的凋亡。

本研究证实了黄连素能抑制胰腺癌细胞的增殖，提高胰腺癌细胞的凋亡率，而且探讨了黄连素诱导胰腺癌细胞凋亡的可能途径。为胰腺癌的治疗开辟了一条新的出路。而且黄连素药源丰富，价格低廉、不良反应小，在临床上开发好黄连素的抗肿瘤作用具有较好的应用前景，为广大肿瘤患者带来福音。

4参考文献

[1]张海荣，孟祥伟，徐光.胰腺癌的临床诊断进展[J].吉林医学，2007,28(13):1522.

[2]Li XK，Motwani M，Tong W，et al.Huanglian，A chinese herbal extract，inhibits cell growth by suppressing the expression of cyclinB1 and inhibiting CDC2 kinase activity in human cancer cells[J].Mol Pharmacol,2000，58(6):1287.

[3]Mitani N，Murakami K，Yamaura T，et al.Inhibitory effect of berberine on the mediastinal lymph node metastasis produced by or-thotopic implantation of Lewis lung carcinoma[J].Cancer Lett，2001，165(1):35.

[4]Chung JG，Chen GW，Hung CF，et al.Effects of berberine on arylamine N-acetyltransferase activity and 2-aminofluorene-DNA adduct formation in human leukemia cells[J].Am J Chin Med，2000,28(2):227.

[5]Iizuka N，Miyamoto K，Hazama S，et al.Anticachectic effects of Coptidis rhizoma，an anti-inflammatory herb,on esophageal cancer cells that produce interleukin 6[J].Cancer Lett，2000，158(1):35.

[6]L Galluzzi,O Kepp,G Kroemer.Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy[J].Oncogene，2011，31(23)：2805.

[收稿日期：2013-11-04编校：陈伟/郑英善]