酸性复灌液对缺血再灌注心肌内质网应激葡萄糖调节蛋白78的影响

心肌缺血再灌注(I/R)期间导致过度内质网应激(ERS),并通过内质网相关凋亡途径引起细胞凋亡而导致心肌损伤川.缺血后处理可通过调控ERS反应程度,抑制I/R诱导的过度ERS,减轻内质网凋亡信号介导的细胞凋亡而发挥心肌保护作用,而I/R初予以短暂的梯度酸性液复灌可产生与缺血后处理相似的心肌保护效应.我们采用Langendorff离体灌注模型,建立心肌I/R损伤动物模型,通过对ERS分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的研究,探讨酸性梯度复灌液的心肌保护作用机制.　　材料与方法　　1.材料:健康SD大鼠由青岛市药检所动物中心提供,肌钙蛋白I(cTn功试剂盒购自RD公司,原位末端转移酶标记(TUNEL)凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,总RNA提取及逆转录(RT)试剂盒购自TaKaRa公司,聚合酶链反应(PCR)试剂盒为武汉博士德产品,通用型免疫组织化学二抗试剂盒购自美国Zymed公司.　　2实验分组:健康SD大鼠24只,雌雄不拘,体质量200一400g,随机分为3组(n=8):正常对照组(C),常规灌注pH7.4HEPES-KH液180min;缺血/再灌组(I/R),灌流20min后缺血60min,恢复灌注pH7.4HEPES-KH液100min;酸性灌注组(E),灌流20min后缺血60min,先用pH6.8HEPES-KH液灌注5min,然后换成pH7.1HEPES-KH液灌注5min,最后以pH7.4HEPES-KH液灌注90min}HEPES-KH缓冲液成分(mmol/L);NaCl118.5,KCl4.7,CaClz1.8,MgS041.2,HEPES20.0,KHZP041.2,Glucose11.1.pH值根据应用情况用SNHCL或SNNaOH调整为7.4,7.1,6.8.使用时新鲜配制,经0.45Nm滤器过滤,灌流液以100%OZ持续平衡并维持在37℃.　　3.标本采集:实验结束后,取大鼠左心室前壁同一部位心肌组织,用于心肌细胞凋亡检测及免疫组织化学分析;其余左心室心肌组织放于冻存管中,液氮速冻后一80℃冰箱保存.　　4.cTnl浓度测定:灌流结束时取冠脉流出液10ml,采用免疫双抗体夹心法检测cTnI浓度,检测范围为0一30p,群L,分析灵敏度为0.O1p.　　5.大鼠心肌细胞凋亡测定:采用TUNEL法,按试剂盒说明进行心肌细胞凋亡的原位检测.光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色,凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色.每张切片于凋亡细胞分布区域各取10个高倍视野,计算出平均每L00个细胞中的凋亡细胞数,并以百分数(%)表示凋亡指数(AI);AI(%)=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数x100%.　　6.RT-PCR检测大鼠心肌组织GRP78的表达:取大鼠左心室心肌,加人胰酶消化按常规程序获取心肌细胞,裂解细胞.用Trizol提取总RNA,将RNA逆转录成cDNA,再进行PCR扩增.GRP78引物序列为:上游5'-GACATCAAGTTCT'I'GCCGTT-3',下游5'-CT-CATAACATTTAGGCCAGC-3’,扩增产物260by一肌动蛋白((3-actin)引物序列为:上游5'-TGGCATC-CACGAGACCACCTTCA-3',下游5'-GACTGCTGT-CACCTTCACCGTTCC-3',扩增产物496by.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后用ChemiDocXRS凝胶成像系统进行半定量分析,以平均灰度值表示表达量.　　7.GRP78蛋白表达:应用Westernblot方法检测.各组实验结束后,取左心室心肌,加人胰酶消化按常规程序获取心肌细胞,加人十二烷基硫酸钠(SDS)加样缓冲液裂解细胞,经水浴、离心,收集上清,采用二咬琳甲酸(RCA)法进行蛋白定量.每一样品(50},g)与等体积的2x上样缓冲液混匀,经电泳分离,转膜,封闭后,加人GRP78(1:1000)多克隆抗体孵育过夜,然后加人第二抗体室温孵育,经增强化学发光(ECL)显色发光,放射自显影检测,分析测定GRP78蛋自条带扫描灰度变化.　　8.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,计量资料以均数士标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验.　　结果　　1.各组大鼠心肌流出液cTnl检测结果:与C组(1.3士0.4)g/L比较,I/R组(12.5士3.2)L和E组(6.711.6)ng/LcTnI浓度均增高(P<0.01)0与I/R组比较,E组cTn工浓度均降低(P<0.01).　　2.大鼠心肌细胞凋亡结果:C组心肌细胞凋亡较少,AI为(3.5士1.1)%,I/R组[(27.9士5.3)%较C组明显增力II(P<0.01),而E组[(18.0士3.9)%〕较I/R组明显降低(P<0.01).　　3.RT-PCR测定大鼠心肌GRP78表达结果(图1);GRP78表达水平C组(0.43士0.04)明显低于I/R组(0.95士0.07)和E组(0.62士0.06,P<0.0l),而I/R组明显高于E组(P<0.01).　　4.大鼠心肌GRP78蛋白检测结果(图2):Gi}p7s表达水平C组(384士75)明显低于I/R组(769士132)和E组(542士98)(P<0.01),而I/R组明显高于E组(P<0.O1).　　讨论　　我们在离体心脏进行研究显示,酸性复灌液具有心肌保护作用,其机制未完全阐明.内质网是真核细胞中重要的细胞器,I/R过程中的多种刺激因素导致内质网内未折叠或错误折叠蛋白质聚集以及钙稳态失衡等均可引起内质网功能障碍,触发ERS适度ERS导致内质网内促生存的蛋白分子表达增加,从而减轻心肌损伤;但若内质网损伤太过严重,内环境稳定不能及时恢复,ERS将诱导促凋亡因子活化,导致细胞凋亡〔78〕.　　GRF'78是ERS的标志性分子伴侣蛋白,ERS时,CRP78与聚集的未折叠蛋自结合,促进其折叠,GRP78过表达可增强内质网处理未折叠蛋白的能力本实验结果显示,缺血再灌注与酸性复灌液复灌均使GRF'78表达调,而酸性复灌液复灌可降低GRP78表达升高的幅度,诱导GRP78表达轻度增加,表明酸性复灌液复灌产生的心肌保护作用与ERS有关,且可减轻I/R导致的过度ERS.然而,低pH液复灌如何通过细胞内信号转导调节ERS目前仍然不清楚.　　本研究结果表明,心肌I/R初期短暂低pH液梯度复灌产生的心肌保护作用通过调节GRP78表达,抑制I/R导致的过度ERS,减轻内质网相关凋亡而产生心肌保护效果.　　参考文献　　Okada K,Minamino T,Tsukamoto Y. Prolonged endoplasmic reticulum stress in hypertrophic and failing heart after aortic constriction:possible contribution of endoplasmic reticulum stress to cardiac myocyte apoptosis[J].Circulation,2004.705-712.　　姚树桐,刘秀华,王家富. 缺血后处理抑制缺血再灌注大鼠心肌内质网应激相关凋亡[J].微循环学杂志,2008,(1):16-19.doi:10.3969/j.issn.1005-1740.2008.01.017.　　Liu XH,Zhang ZY,Sun S. Ischemic postconditioning protects myocardium from ischemia/reperfusion injury through attenuating endoplasmic reticulum stress[J].Shock,2008,(4):422-427.doi:10.1097/SHK.0b013e318164ca29.　　孙忠东,高尚志,池一凡. 蛋白激酶C和线粒体ATP敏感性钾.通道在未成熟心肌预处理中的作用[J].中华实验外科杂志,2007,(3):265-267.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.03.003.　　孙忠东,夏家红,董念国. 酸性HEPES-KH液对离体未成熟心肌的作用[J].中华实验外科杂志,2011,(1):102-104.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.038.　　Inserte J,Barba I,Hemando V. Delayed recovery ot intracellular acidosis during reperfusion prevents calpain activation and determines protection in postconditioned myocardium[J].Cardiovascular Research,2009.116-122.