慢病毒介导的shRNA靶向干扰β-catenin神经母细胞瘤稳定细胞株的建立

发表时间：2014-10-21 浏览次数：977次

引用：

姚伟,李凯,徐挺等.慢病毒介导的shRNA靶向干扰β-catenin神经母细胞瘤稳定细胞株的建立[J].中华小儿外科杂志,2013,34(4):290-294.

关键词：

神经母细胞瘤 RNA干扰慢病毒属

作者：

姚伟李凯徐挺肖现民王作鹏

作者单位：

复旦大学附属儿科医院外科,上海,201102

出版年份：

2013

期刊页数：

290-294.

收录者：

知网,万方

摘要：

目的建立稳定抑制β-eatenin基因表达的入神经母细胞瘤BE2C细胞株,为探讨Wnt/-eatenin信号在神经母细胞瘤发生中的作用提供细胞模型.方法使用Real-time PCR、Westernblot的方法检测BE2C细胞中β-catenin在基因及蛋白水平的表达.于β-catenin基因编码区选择4个siRNA靶点及1个非编码序列(NC)合成5对shRNA干扰序列,分别与质粒PgLV-H1-GFP+ Puro载体连接,构建重组质粒；将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染BE2C细胞,筛选出干扰效果最佳的shRNA序列,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株.RT-PCR、Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率.结果 RT-PCR、Western blot检测显示BE2C细胞中β-catenin在基因及蛋白水平均有较好的表达；慢病毒的滴度达到1×108 TU/ml时,侵染BE2C细胞的效率可达到90％左右；通过RT-PCR和Western blot检测结果显示G1为最有效的干扰靶点；通过嘌呤霉素筛选得到稳定靶向干扰β-catenin细胞株,抑制效率可达约90％.结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-eatenin基因表达的人神经母细胞瘤BE2C细胞株,为进一步研究β-catenin在神经母细胞瘤发生中的作用提供了可靠的细胞模型.

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