急性冠状动脉综合征患者血清调节性T细胞的变化及其临床意义
发表时间：2010-02-08 浏览次数：627次
急性冠状动脉综合征患者血清调节性T细胞的变化及其临床意义作者：凌佳 朱彦琪 金炜 作者单位：上海市南汇区中心医院心内科 上海市交通大学附属第一人民医院心内科 【摘要】 目的 通过检测急性冠状动脉综合征患者（ACS）外周血中调节性T细胞（Treg细胞）的数量变化，了解Treg细胞与ACS发生发展的关系及意义。方法 入选40例急性心肌梗死患者（心梗组）、40例不稳定型心绞痛患者（心绞痛组）和40名健康人（对照组）。所有入选受试对象外周血血液样本均采用流式细胞术检测CD4+CD25+CD127-的结果来定义各组外周血中Treg细胞表达的百分比，比较各组的Treg细胞表达百分比，同时比较心梗后12、48、72 h Treg细胞表达百分比变化。常规检测血常规、血脂。结果 外周血中Treg细胞表达的百分比［心绞痛组（3.20%±0.92%）比对照组(3.76%±1.18%)］有所下降，差异有统计学意义（P<0.05），心梗后12 h（2.12%±0.89%）患者外周血中Treg细胞表达的百分比也明显下降（P<0.001）；心梗后12 h（2.12%±0.89%）、48 h（3.0%±0.89%）、72 h（3.57%±0.92%）的Treg细胞百分比逐渐递增。心梗后各时间点两两比较，差异均存在统计学意义（P<0.05）。心梗后72 h Treg细胞百分比与对照组相比差异无统计学意义。心梗组常规检测血常规中白细胞［(10.34±2.48）×109/L］、中性粒细胞(0.80±0.06)较正常值显著异常升高，且中性粒细胞与Treg细胞百分比呈负性相关（相关系数r为-0.517，P<0.05）。结论 急性冠脉综合征患者Treg细胞数量减少，且与炎症反应呈负性相关，故可推测Treg细胞是ACS患者免疫稳态失衡和炎症反应的标志物之一。 【关键词】 冠状动脉疾病； T淋巴细胞，调节性; 全身炎症反应综合征 Clinical significance of regulatory T cells in peripheral blood of patients with acute coronary syndrome LING Jia*, ZHU Yanqi, JIN Wei. *Department of Cardiology, Nanhui Central Hospital, Shanghai 201300, China Corresponding author: JIN Wei, Email:JW_8585@hotmail.com 【Abstract】 Objective To investigate the abnormality of CD4+ CD25+ regulatory T cell in peripheral blood of patients with acute coronary syndrome（ACS）and to identify its relationship with arteriosclerosis. Methods Flow cytometry was used to detect the frequencies of CD4+ CD25+ regulatory T cells in peripheral blood from 40 patients with acute myocardial infarction (AMI), 40 patients with unstable angina (UA), and 40 normal individuals. All patients had been ruled out infection, disease of immune system, malignant tumor and so on. The frequencies of regulatory T cells in all patients were detected. Levels of CD4+ CD25+ CD127- in circulation were measured to determine the number of Treg cells by flow cytometry. Meanwhile, the frequencies of CD4+ CD25+ regulatory T cells in peripheral blood were detected in AMI patients after 12 h, 48 h and 72 h. Results Compared to controls, the frequencies of CD4+ CD25+ regulatory T cells in peripheral blood of AMI and UA group were significantly decreased (all P<0.05). The frequencies of CD4+ CD25+ regulatory T cells in peripheral blood 12 h, 48 h and 72 h after AMI were increased progressively. Compared to 12h, the frequencies of Treg cells in peripheral blood 48 h and 72 h after AMI were significantly raised (P<0.05). In contrast ,the levels of WBC ［(10.34±2.48)×109/L］ and percent neutrophils (0.80±0.06) in AMI group were markedly higher than those in the UA group and controls (all P<0.05). There was a negative correlation between the frequencies of CD4+ CD25+ regulatory T cells and neutrophil in AMI group (r=-0.517，P<0.05）.Conclusion In ACS patients, the decrease in frequencies of Treg may break the balance of peripheral immunotolerance and participate in pathological process of inflammatory response inducing the development of ACS. 【Key words】 Coronary artery disease; Tlymphocyte, regulatory; Systemic inflammatory response syndrome CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）是一个具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，它能够抑制自身免疫性疾病的发生，维持机体内环境的稳定。而冠状动脉硬化是一种炎症性疾病，固有的和获得性的免疫炎症机制参与其中。现已经证明，在动物模型中，参与动脉粥样硬化的T细胞主要是1型辅助性T细胞（T helper type 1，Th1），而最近很多证据表明，一种新的T细胞亚型（CD4+CD25+调节性T细胞）可能参与动脉粥样硬化的发生和发展过程。我们观察CD4+CD25+调节性T细胞在急性心肌梗死、不稳定型心绞痛时和心肌梗死后不同时间点Treg细胞的变化情况来探讨调节性T细胞在炎症反应中的作用。1 对象和方法 1.1 病例选择 选择2007年10月至2008年2月上海市第一人民医院患者120例，其中急性冠脉综合征患者80例，包括急性心梗患者40例［男性26例，女性14例，年龄（64.6±10.8）岁］，不稳定型心绞痛患者40例［男性32例，女性8例，年龄（60.2±10.2）岁］；健康对照组40名［男25名，女15名，年龄（65.9±9.8）岁］。所有病例的入选标准：（1）心梗患者诊断标准:持续剧烈胸痛30 min以上；典型心电图动态演变；心肌损伤标志物［肌酸激酶同工酶(CKMB),或肌钙蛋白等］有动态变化。符合以上任何2项可确诊，发病时间在12 h之内；(2)不稳定型心绞痛诊断标准:除外稳定型劳力性心绞痛以外的缺血性胸痛,近48 h内有静息或自发性心绞痛发作至少1次，持续时间小于20 min，有一过性缺血性ST段压低(≥0.1 mV)伴或不伴有T波的改变，但CKMB的升高低于正常高值的2倍,经冠脉造影证实至少有1支冠状动脉狭窄程度大于50%。对照组为体检人群，排除有动脉血管缺血临床表现的患者，并与心绞痛组、心梗组患者年龄及性别匹配。所有研究对象均排除急性呼吸道、泌尿道及其他部位感染、慢性呼吸道、胃肠道及泌尿系疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤、长期服用激素等免疫抑制剂以及心功能不全的患者。 1.2 仪器和试剂 Coulter流式细胞仪 （美国贝克曼库尔特公司）检测Treg细胞数。主要试剂为PECy5 antihuman CD127、PECy5 Mouse IgG1（美国eBioscience公司） FITCCD4 抗体、PECD25 抗体（美国BD公司）。 1.3 研究方法 Treg细胞的检测：Foxp3及其编码的蛋白Scurfy在CD4+CD25+Treg细胞上特异性表达，也是CD4+CD25+Treg的特征性标记物［1］，但是对于Foxp3的检测复杂且困难。有研究证明，Treg细胞表面的CD127(IL7受体)与Foxp3呈负相关，可以作为CD4+CD25+T细胞的生物标记［2］，且CD127的检测相对简单，故本实验选用CD4+CD25+CD127-来定量Treg细胞。 1.3.1 检测方法 所有入选受试对象采集静脉血样，对照组及心绞痛组均于清晨采集空腹肘部静脉血；急性心梗组患者于入院时即刻采集静脉血（心梗后12 h内），心梗后24、72 h均于清晨采集空腹肘部静脉血2 ml。 2 ml静脉血行肝素钠抗凝（于8 h内检测），进行流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127-细胞数。1.3.2 流式细胞仪检测方法 取干净的空试管，均加入FITCCD4抗体、PECD25抗体、CD127抗体（PECy5 antihuman CD127）各10 μl，加入抗体时注意贴壁，3种抗体间切勿接触，避免造成抗体量的损失，然后加入血样100 μl，同样避免接触抗体，摇匀后，避光孵育30 min，取另一试管加入FITCCD4抗体、PECD25抗体、IgG1（PECy5 Mouse IgG1）各10 μl，加入血样100 μl，摇匀、避光孵育30 min作为阴性对照，最后上机检测。 1.3.3 血液常规及生化检测 采集清晨空腹肘部静脉血，常规检测血常规白细胞、中性粒细胞比、血脂等指标。 1.4 数据处理及统计分析 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，心梗组、心绞痛组及对照组间运用方差分析，对各组资料进行统计分析， P<0.05为差异有统计学意义。 心梗后12 h内调节性T细胞数量与血常规指标的对应关系应用线性相关分析方法，作出散点图，并表示为线性相关方程，得出线性相关系数，用r表示，其值越接近1或-1，两者的相关性越强。2 结果 2.1 患者基本资料比较 本研究选择的患者在各组间的性别、年龄具有可比性（P>0.05），3组间总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、载酯蛋白ApoA1、B差异均无统计学意义（P>0.05）（表1）。 2.2 各组外周血中Treg细胞水平比较 与对照组相比，心绞痛组Treg细胞及心梗组Treg细胞均有明显减少（P<0.05），且以心梗组最明显（心梗后12 h），见表2；心梗后3个时间点的Treg细胞表达百分比随时间延长呈逐渐上升趋势，与正常组比较，心梗后12、48 h时间点Treg细胞显著减少，结果比较，差异均有统计学意义（P<0.05），而心梗后72 h内差异无统计学意义，且基本恢复至正常水平，见表2。 注：与对照组比较，aP<0.05,bP<0.01 2.3 常规检测血常规的结果 对照组、心绞痛组的白细胞数值在正常范围内，心梗组白细胞数值、中性粒细胞比大于正常值。心绞痛组与对照组相比，差异无统计学意义，而心梗组有极显著的统计学意义（P<0.01）。见表3。±s）注：与对照组比较，aP<0.01 2.4 Treg细胞表达百分比与血常规指标的相关性分析 对于心梗组(12 h)的Treg细胞表达百分比结果与血常规中白细胞及中性粒细胞百分比结果进行线性相关和回归分析，结果显示Treg细胞表达百分比与中性粒细胞百分比的相关系数为-0.517，P<0.01，说明两者存在负的直线相关，有统计学意义。若以Treg细胞数作为自变量X，中性粒细胞数则为Y，那么两者间的对应关系可以简单的描述为公式Y=88.065-3.376X，见图1。 r=-0.517,P<0.013 讨论 冠状动脉粥样硬化已是目前严重威胁人类健康和生命的疾病，其发病过程以炎症为主要特征，在斑块形成早期，我们就可以发现斑块内有T淋巴细胞的聚集［3］，T淋巴细胞可产生和释放各种炎性细胞因子，促进血管内皮细胞黏附分子、细胞因子的表达，促发血管损伤及斑块进展，导致斑块破裂、血栓形成，最终引发心肌梗死。 近年来对于调节性T细胞，尤其是CD4+CD25+调节性T细胞的研究渐渐深入，发现该类细胞在自身免疫性疾病、移植耐受、微生物感染、肿瘤及过敏性反应中均起着一定的作用［45］。且多项动物研究表明，Treg细胞与动脉粥样硬化有相关性 ［67］，同时有少数涉及人体的临床研究，得到了ACS患者的Treg细胞数量减少且功能下降的结果［8］，证明Treg细胞参与了炎症反应的过程。 本研究以流式细胞仪检测急性心梗、不稳定型心绞痛患者及对照组的Treg细胞表达水平证实Treg细胞与炎症反应的关系。该研究中ACS患者在入院后均常规服用他汀类降脂药物，故血脂指标差异无统计学意义，这也排除了高血脂对于Treg细胞数的影响，而他汀类药物对于Treg细胞数是否直接产生影响，则需要进一步研究。本研究结果发现，与对照组相比，不稳定型心绞痛组、心梗组（心梗后12、48 h）的Treg细胞表达百分也有明显的减少，且存在统计学差异。在不稳定型心绞痛、急性心梗的患者，存在局部炎症反应的激活，粥样斑块不稳定，甚至破裂，而这部分患者的Treg细胞较正常组明显减少，表明Treg细胞与此类炎症反应有着相关性，冠状动脉粥样硬化的患者，有免疫系统的活化参与其中，其免疫调节功能受到一定的抑制。此外，心梗后12、48、72 h Treg细胞数量以心梗后12 h内减少最明显，随着心梗后时间的延长而逐渐上升，表明急性心梗时免疫调节功能受到明显的抑制或破坏，越接近急性期，抑制作用越明显。而心梗后72 h已度过急性期，此时的Treg细胞基本恢复正常水平。另外，根据该实验结果，我们推测，Treg细胞的数量动态变化可作为急性心梗的非侵入性诊断指标之一。 ACS的发生发展以炎症反应为主要特征。研究表明，人类白细胞作为组织损伤的介导者，在冠脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要的作用［9］。白细胞特别是中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，是动脉粥样硬化形成的早期病理生理变化之一。急性心肌梗死的病理过程中，白细胞跨内皮迁移至血管壁间隙引起了组织损伤和炎症反应。 另外，对高危胸痛患者进行研究［1011］发现：CKMB及中性粒细胞计数与急性心梗独立相关；对于急性心梗患者，中性粒细胞计数越高，症状发作距血栓溶解时间越长。由此我们可以相信，白细胞及中性粒细胞的变化可以描述急性心梗患者本身炎症反应的程度。而本研究针对白细胞及中性粒细胞进行统计研究发现，心梗组白细胞、中性粒细胞出现异常升高，同时Treg细胞表达百分比水平与中性粒细胞百分比水平的相关性分析显示两者存在负性相关，表明急性心梗时炎症反应高度激活，且Treg细胞的数量变化与炎症反应激活程度呈负性相关。 本实验的结果表明，Treg细胞与炎症反应密切相关，Treg细胞数量减少破坏外周循环免疫稳态，造成了炎症反应激活而使硬化斑块不稳定。这项结果与其他相关的研究结果一致［8］。但目前仍有很多有待解决的问题：（1）Treg细胞数量变化是否与心肌坏死面积有关；（2）Treg细胞的数量测定是否可以作为诊断及评价预后的指标；（3）针对Treg细胞的作用机制，我们是否可以在将来的研究中以不同的方式将Treg外界干预病变个体或部位，达到治疗及预防效果。 尚有种种未知，期待我们进一步深入研究。【参考文献】［1］Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor foxp3. Science, 2003, 299: 1057.［2］Ross R. Atherosclerosis an inflammatory disease. New Engl J Med, 1999, 340:115.［3］Stary HC, Chandler AB, Glagov S, et al. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis: a report from the committee on vascular lesions of the council on arteriosclerosis. Amer Heart Association. Circulation,1994,89:24622478.［4］Lan RY, Ansari AA, Lian ZX, et al. Regulatory T cells: development, function and role in autoimmunity. Autoimmun Rev, 2005, 4:351363.［5］Terabe M, Berzofsky JA. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Curr Opin Immunol, 2004, 16:157162.［6］Ruth M, Galina S, Faria AM, et al. Mucosal administration of heat shock protein65 decreases atherosclerosis and inflammation in aortic arch of lowdensity lipoprotein receptordeficient mice. Circulation, 2002, 106: 1708.［7］Mallat Z, Gojova A, Brun V, et al. Induction of a regulatory T cell type 1 response reduces the development of atherosclerosis in apolipoprotein Eknockout mice. Circulation, 2003,108: 12321237.［8］胡英锋，李大主，杨克平,等.急性冠脉综合征患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的检测及意义.免疫学杂志，2007，23：433435.［9］Madjid M, Awan I, Willerson JT, et al. Leukocyte count and cornary heart disease: implications for risk assessment. J Am Coll Cardiol, 2004, 44:19451956.［10］Basili S, di Francoi M, Rosa A, et al. Absolute neutrophil counts and fibrinogen levels as an aid in the early diagnosis of acute myocardial infarction. Aota Cardiol，2004，59：135140.［11］Wang CK，French JK，Gao W，et al. Relationship between initial white blood cell counts，stage of acute myocardial infarction evolution at presentation，and incidence of thrombelysis in myocardial infarction3 flow after streptokinase. Am Heart J，2003，145：95102.
