黄芪总黄酮对豚鼠心室肌细胞钾离子通道的作用
发表时间：2010-02-22 浏览次数：503次
黄芪总黄酮对豚鼠心室肌细胞钾离子通道的作用作者：于影, 赵 明, 刘贝贝, 邵慧杰 作者单位：内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000 【摘要】 目的 研究黄芪总黄酮( totalflavonoids of ast ragalus, TFA)对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK) 、内向整流钾电流(IK1)的作用。方法 胶原酶酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞, 利用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的延迟整流钾电流、内向整流钾电流。结果 （1） 应用TFA（20 mg·kg–1） 后IK 从（1.21±0.24）nA 降至(0.96±0.27)nA( P< 0.01, n=6) ，而TFA（40 mg·kg–1）组IK 从（1.45±0.36）nA下降到（1.01±0.27）nA，差异有统计学意义( P<0.01，n=6)。（2）应用TFA（20 mg·kg–1 ，40 mg·kg–1）后与对照组比较, TFA（20 mg·kg–1 ，40 mg·kg–1）分别使内向整流钾电流(IK1)峰值从（-8.93±2.03）nA和(-8.83±1.56) nA下降到(-8.87±1.58) nA和(-8.54±1.37) nA，差异无统计学意义 ( P>0.05，n=6) 。结论 TFA可以降低豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流（IK）的幅度，呈剂量依赖性。TFA对豚鼠心室肌细胞内向整流钾通道（IK1）作用不明显。 【关键词】 黄芪； 心肌； 豚鼠 The effects of totalflavonoids of astragalus on potassium channel of guinea pig ventricular myocardial cells. YU Ying1，ZHAO Ming1，LIU Beibei2，SHAO Huijie2.1. Department of Cardiology, Innermongolia National University Hospital, Tongliao 028000; 2. Second Clinical Medicine Department, Jilin University, Changchun 130021, China Abstract: Objective To study the effects of totalflavonoids of astragalus (TFA) on the delayed rectifier potassium current (IK) and the inward rectifier potassium current (IK1) in guinea pig isolated ventricular myocardial cells. Methods Guinea pig ventricular myocardial cells were isolated and whole cell patch clamp technique was applied to record the IK and IK1. Results （1） Under 20 mg/kg TFA, IK significantly decreased from (1.18±0.27) nA to (0.94±0.25) nA (P< 0.01, n=6); under 40 mg/kg TFA, IK decreased from (1.42±0.33) nA to (1.01±0.29) nA (P< 0.01, n=6). （2） Under 20 mg/kg TFA, IK1 decreased from （-8.93±2.03）nA to (-8.83±1.56)nA (P>0.05, n=6); under 40 mg/kg TFA, IK1 decreased from (-8.87±1.58) nA to (-8.54±1.37) nA (P>0.05, n=6). Conclusions TFA remarkably inhibits IK in guinea pig ventricular myocardial cells with a dosedependence pattern; while it shows no effect on IK1. Key words: Astragalus membranaceus; Myocardium; Guinea pigs 黄芪具有显著的益气强心作用。在临床上除了用于治疗冠心病心绞痛外,还能够治疗高血压、低血压、病毒性心肌炎、肾炎、脑梗死、心律失常等［1］。现代药理研究分析，黄芪的化学成分主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等。黄酮的不同化学成分具有不同的药理活性。黄芪总黄酮(totalflavonoids of ast ragalus, TFA)是从豆科类植物黄芪中分离出来的有效活性部位，试验表明它具有清除多种自由基的功效，并且对自由基所致细胞膜蛋白质以及DNA损伤有保护作用［2］。 TFA对心肌细胞电生理的作用、对内向整流钾电流( IK1)和延迟整流钾电流（IK）的作用报道较少。本研究采用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的IK、IK1［3］，观察TFA对心室肌细胞IK1和延迟整流钾电流的影响，来阐明黄芪抗心律失常的作用机制。1 材料和方法 1.1 材料 TFA由内蒙古民族大学有机化学实验室提供，豚鼠（雌雄不拘，重300～350 g）由内蒙古民族大学基础医学院动物中心提供。 1.2 溶液配制 （1）有钙台液（mmol·L1）：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2·2H2O 1.8，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5；用NaOH 将pH 调至7.4。无钙台液（mmol·L1）：NaCl 143，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5；用NaOH 将pH 调至7.4。储存液（mmol·L1）：KOH 70，Lglutamic 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2·6H2O3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1.5，用KOH 将pH 调至7.4。酶溶液：无钙台液+0.4 g/L collagenase+0.1 g/L protease；（2）记录延迟整流钾通道(IK)的电极内液成分(mmol/L):KCl 45，Kaspartate 85, Napyruvate 5, MgATP 5, EGTA10，HEPES10, Glucose11,用KOH调pH至7.3，记录IK的细胞外液为无钙Tyrode液。记录内向整流钾通道（IK1）电极内液(mmol/L): KCl 140 ,CaCl2H2O 1, K2ATP 5 , EGTA 10 , HEPES 5 ;细胞外液:CholineCl 145, KCl 5, MgCl2H2O 1, EGTA 5, HEPES 10, Glucose 10。（3） TFA按20 mg·kg1和40 mg·kg 1加蒸馏水分别制备成不同浓度的溶液备用。 1.3 豚鼠心室肌细胞急性分离方法 豚鼠6只急性处死后，迅速开胸取出心脏，置于冰冷有钙台液中。行主动脉插管后固定于Langendorff 灌流架上逆向灌流心脏，有钙台液1.5 min，无钙台液6 min，酶溶液13 min，储存液3 min。灌流完毕后，沿房室沟剪下心室部分，用眼科剪将心室肌剪成小碎块，置于盛有储存液的三角烧杯中，在37℃的水浴箱中轻轻振荡10 min，吸取上清液置于离心管中，离心5 min后弃上清液，加入储存液，于4℃的冰箱中保存备用。 1.4 实验分组及数据的采集和处理 随机选取心室肌细胞分为正常对照组、TFA（20 mg·kg1）组、TFA（40 mg·kg1）组共3组。在实验中，应用Pclamp 6.0 程序中的Clampex 程序记录出原始的心室肌细胞全细胞膜电流图形，再应用Pclamp 9.0 程序中的Clampfit程序对心室肌细胞IK、IK1的全细胞膜电流作统计分析。 1.5 统计学处理 用SPSS11.0统计软件进行数据统计，计量指标用均数±标准差（x±s） 表示，各组之间比较采用样本均数ｔ检验，P<0.05认为差异有统计学意义。2 结果 2.1 TFA对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)的作用 采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)时，细胞外液中的Cd2+具有阻断Ca2+电流的作用，TTX 具有阻断Na+电流的作用，4AP 具有阻断瞬时外向钾电流（Ito)，因而保证了实验中记录到的外向电流为纯净的IK。将保持电位置于－40 mV , 以10 mV 为阶跃, 自-40 mV 去极化至+50 mV , 时程400 ms,得到一组IK 值，以电流对测试电压作图, 可得到IK的电流电压关系( ⅠⅤ)曲线［4］。 实验显示, 应用TFA（20 mg·kg1）后IK 的变化差异有统计学意义，在+50 mV 指令电压下, 心室肌细胞的 IK 从（1.21±0.24）nA 降至(0.96±0.27)nA( P<0.01)，应用TFA（40 mg·kg1）后心室肌细胞的IK从（1.45±0.36）nA下降到（1.01±0.27）nA，差异有统计学意义 ( P<0.01)。见图1，2。 2.2 TFA对豚鼠心室肌细胞IK1的作用 采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞IK1 时，加入细胞外液Cd2+具有阻断Ca2+电流的作用，TTX 具有阻断Na+电流的作用，用4AP 具有阻断瞬时外向钾电流（Ito)，因而保证了实验中记录到纯净的IK1［5］。 将保持电位置于－40 mV , 给予－100～30 mV、阶跃10 mV、持续300 ms 的指令电压, 得到一组稳态电流值, 且不随时间而改变, 即IK1 , 表现出内向整流的特性。以电流对测试电压作图, 可得到IK1电流与电压关系(ⅠⅤ) 曲线。结果显示，加入TFA与对照组比较, TFA（20 mg·kg1 ，40 mg·kg1）分别使IK1峰值从（-8.93±2.03）nA和(-8.83±1.56) nA下降到(-8.87±1.58) nA和(-8.54±1.37) nA，差异无统计学意义 ( P>0.05) ，见图3，4。A：TFA（20mg·kg1）对延迟整流钾电流的影响；B：TFA (40mg·kg1)对延迟整流钾电流的影响3 讨论 黄芪是补中益气的中草药 , 具有调整免疫功能、补充微量元素的作用 ,临床上广泛应用于心肌炎与心肌病的治疗, 文献报道，黄芪可以明显减少心肌炎的心律失常发生率［7,8］,但作用产生机制不明。从本研究观察到，TFA（20、40 mg·kg1） 可降低豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流（IK）的幅值，同时观察到TFA对豚鼠心室肌细胞内向整流钾通道（IK1）没有作用。这个实验结果是与TFA对豚鼠心室肌细胞动作电位的作用相符合的。可以明确解释TFA对豚鼠心室肌细胞动作电位的作用机制，同时也部分揭示了黄芪抗心律失常的作用机制。 众所周知，心肌细胞动作电位的时程（APD）长短与复极时钾离子通道的状态密切相关。TFA可以使动作电位时程特别是APD50明显延长［6］，而IK状态决定APD50时程。我们在实验中观察到，TFA可降低豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流（IK）的幅值，明显抑制IK开放，这样我们就可以得出TFA对豚鼠心室肌细胞动作电位的作用机制是由于TFA抑制IK开放，进而延长动作电位复极时程。还观察到TFA对豚鼠心室肌细胞内向整流钾通道（IK1）没有作用。这一实验结果也可以很好解释TFA对豚鼠心肌细胞动作电位的作用机制，因为心肌细胞内向整流钾通道的开放与静息电位水平密切相关。一般情况下，心肌细胞静息电位超极化时内向整流钾通道的开放，促使静息电位超极化向极化状态转变。文献报道，TFA对豚鼠心肌细胞静息电位值没有影响［6］，这与本研究观察到的结果是相符合的。 本实验结果显示，TFA明显抑制IK开放，延长动作电位复极时程。这一作用具有抗心律失常发生的作用。因为TFA能抑制心室肌细胞延迟整流钾电流的幅值，可以导致动作电位复极时程延长，有效不应期延长，从而消除触发活动和折返激动，减少心律失常发生率［8］。这一作用与传统的Ⅲ型抗心律失常药发挥作用的途径是一致的，传统的Ⅲ型抗心律失常药作用机制正是抑制心肌复极时钾离子外流，延长动作电位时程。从而实现其抗心律失常作用的［8］。在未来，TFA有可能被开发成一种新型的抗心律失常药应用于临床。【参考文献】［1］ 周吉燕, 樊 懿, 孔建龙，等.黄芪中不同提取成分对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的心功能影响［J］. 中国中药杂志，2000，25:301302.［2］ 王立云. 黄芪的化学成分及其药理作用［J］. 中国社区医师 , 1999：10481050.［3］ Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. 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