丝光绿蝇抗菌物质的超声波诱导
发表时间：2011-08-23 浏览次数：468次
作者：孙斐,姚志军,王东,许兵红 作者单位：新乡医学院寄生虫学教研室，河南 新乡
【摘要】 目的 探讨超声波对丝光绿蝇抗菌物质的诱导表达规律。方法 丝光绿蝇初三龄幼虫经0 W、40 W、80 W、120 W功率超声波处理、经100 W超声波处理3 min、5 min、7 min和超声波诱导后不同时间提取血淋巴，观察其对溶壁微球菌的抑菌效果。结果 0 W、40 W、80 W、120 W超声波处理5 min，诱导后48 h提取的血淋巴对溶壁微球菌的抑菌环直径(mm)分别为：14.33±0.58、21.33±1.04、20.83±0.58、16.33±0.58。100 W分别处理3 min、5 min、7 min，诱导后48 h的抑菌环直径(mm)分别为：18.67±1.26、20.33±0.76、20.17±0.29。100 W处理5 min，诱导后0 h、24 h、48 h、72 h的抑菌环直径(mm)分别为：14.33±0.58、19.83±0.29、20.33±0.76、20.00±0.50。结论 超声波可诱导丝光绿蝇抗菌物质表达，以超声波100 W、5 min诱导后48 h提取为宜。
【关键词】 丝光绿蝇;抗菌物质;超声波;诱导 基金项目：新乡医学院资助课题(编号：2005YJ33)
Antibacterial substances of Lucilia sericata induced by ultrasonic treatment SUN Fei,YAO Zhi-jun,WANG Dong,et al (Department of Parasitology,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China)
Abstract: Objective To investigate the expressive regularity of antibacterial substances of Lucilia sericata induced by ultrasonic treatment.Methods Three instar larvas of Lucilia sericata were treated by 0 W,40 W,80 W,120 W ultrasonic respectively,and were treared for 3 min,5 min,7 min and for different hours by 100 W ultrasonic.Then collecting the hemolymph to observe the bacteriostatic effect angist Micrococcus lysodeikticus.Results Hemolymph was treated by 0 W、40 W、80 W、120 W ultrasonic for 5 min,after being induced for 48 h，the diameters(mm) of bacteriostatic rings were respectively recorded as follows:14.33±0.58,21.33±1.04,20.83±0.58,16.33±0.58.Hemolymph was treated by 100 W ultrasonic for 3 min,5 min,7 min after being induced for 48 h，the diameters(mm) of bacteriostatic rings were:18.67±1.26,20.33±0.76,20.17±0.29.Hemolymph was treated by 100 W ultrasonic for 5 min,after being induced for 0 h,24 h,48 h and 72 h，the diameters(mm) of bacteriostatic rings were:14.33±0.58,19.83±0.29,20.33±0.76,20.00±0.50.Conclusion Expression of antibacterial substances of Lucilia sericata can be induced by ultrasonic treatment and it is best to collect hemolymph after being induced for 48 h by 100 W ultrasonic for 5min.
Key words: Lucilia sericata;antibacterial substance;ultrasonic;induction
对昆虫免疫的研究起始于20世纪80年代初，首次分离纯化到天蚕抗菌肽，为一种小分子的肽类，具有广谱的抗菌活性。昆虫免疫的特点是在外界物质的诱导下，能迅速产生或增加许多体液免疫因子，如凝集素、溶菌酶、抗菌肽等，其中抗菌肽是昆虫体液免疫中重要的抗菌因子。昆虫对外界刺激的免疫应答并不具有专一性，不同的诱导源如生物的、化学的、物理的因子均可诱导昆虫产生抗菌肽。目前，昆虫抗菌肽研究已成为世界科学家关注的焦点之一，均处于基础研究阶段。丝光绿蝇的抗菌物质国内外尚无相关报道，作者首次对丝光绿蝇抗菌物质的针刺诱导表达及部分性质进行了研究[1-3]。又探讨了丝光绿蝇抗菌物质的超声波诱导表达，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 昆虫及饲养 供试验用的丝光绿蝇(Lucilia sericata)由新乡医学院寄生虫学教研室昆虫室室内连续饲养繁殖。幼虫生长条件为：温度26 ℃、相对湿度75%，光照采用60 W白炽灯每日12 h连续照射，幼虫饲料各组分比例如下：麦麸600 g，鱼粉100 g，牛奶粉40 g，酵母粉8 g，蛋白胨15 g，水1 500 mL。各组分混匀后，分装于饲料罐中，灭菌后置于4 ℃冰箱备用。
1.2 应试菌种 溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，由新乡医学院微生物实验室提供，使用前将冻存的菌种从-20 ℃冰箱中取出，立即放置38 ℃～40 ℃水浴中快速复苏，复苏后接种到固体培养基上，37 ℃恒温培养16～18 h备用。
1.3 血淋巴收集 丝光绿蝇幼虫用0 ℃～4 ℃冷水反复冲洗8～10次，再用无菌双蒸水冲洗3次，滤纸吸干虫体表面水分，剪去头部收集血淋巴于1.5 mL离心管中，10 000 r•min-1，离心10 min(上海安亭科学仪器厂，台式离心机，型号：TGL-16G)，取上清液备用，或置于-20 ℃冰箱保存。
1.4 抑菌活力测定 抑菌活力测定采用平板滤纸片法，滤纸片直径6 mm。固体培养基配比如下：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂20 g，加双蒸水至1 000 ml，调pH至6.5，每个直径7.5 cm培养皿加入12 mL培养基制成平板备用。细菌复苏培养后，取培养至对数期细菌配成6×108 cells•mL-1菌液，涂于平板上，将滤纸片加7 μL血淋巴样品，37 ℃培养24 h后测量记录抑菌环直径。
1.5 不同功率超声波的诱导效果实验 丝光绿蝇初三龄幼虫随机分为4组，任选其中1组不加任何诱导，以其血淋巴设为对照，代表0 W的诱导结果，其余3组分别经40 W、80 W、120 W超声波处理5 min，诱导后48 h提取血淋巴，分别观察记录其对溶壁微球菌的抑菌环直径。每组重复3次。
1.6 不同时间超声波处理的诱导效果实验 丝光绿蝇初三龄幼虫随机分为3组，分别经100 W超声波处理3 min、5 min、7 min，诱导后48 h提取血淋巴，分别观察记录其对溶壁微球菌的抑菌环直径。每组重复3次。
1.7 超声波诱导后不同时间的效果实验 丝光绿蝇初三龄幼虫随机分为4组，经100 W超声波处理5 min，于诱导后0 h、24 h、48 h、72 h提取血淋巴，分别观察记录其对溶壁微球菌的抑菌环直径。每组重复3次。
1.8 统计学方法 各组数据均采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 11.5统计学软件，进行单因素的方差分析(1-way ANOVA)。P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 不同功率超声波诱导后的抑菌效果 丝光绿蝇初三龄幼虫分别经0 W、40 W、80 W、120 W超声波处理5 min，诱导后48 h提取血淋巴，对溶壁微球菌的抑菌环直径(mm)分别为：14.33±0.58、21.33±1.04、20.83±0.58、16.33±0.58。0 W与后三者之间存在极显著性差异(P<0.01),40 W与80 W之间差异无显著性，但二者与120 W之间都存在极显著性差异(P<0.01)。
2.2 不同时间超声波诱导后的抑菌效果 丝光绿蝇初三龄幼虫经100 W分别处理3 min、5 min、7 min，诱导后48 h的抑菌环直径(mm)为：18.67±1.26、20.33±0.76、20.17±0.29。三者之间差异无显著性(P>0.05)。
2.3 诱导后不同时间的动态抑菌效果 丝光绿蝇初三龄幼虫经100 W处理5 min，诱导后0 h、24 h、48 h、72 h的抑菌环直径(mm)为：14.33±0.58、19.83±0.29、20.33±0.76、20.00±0.50。0 h与后三者之间存在极显著性差异(P<0.01)，后三者之间差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
昆虫抗菌基因的表达产物有溶菌酶、抗菌蛋白和抗菌肽，其中，溶菌酶和抗菌蛋白只起辅助作用，且不耐高温，抗菌肽是主要的抗菌物质，有一定的热稳定性，具有广谱的抗菌活性及一些特殊的生物活性，在医药、农业、食品防腐上有广阔的应用前景，丝光绿蝇的抗菌肽方面除本课题组外，尚无其他单位的公开研究报道。
实验结果表明，超声波可诱导丝光绿蝇抗菌物质表达。丝光绿蝇初三龄幼虫分别经40 W、80 W、120 W不同功率超声波处理5 min，诱导后48 h提取的血淋巴，对溶壁微球菌均有明显的抑菌效果，且与对照组差异显著，但使用超声波功率太高，抑菌环直径反而减小。超声波功率为120 W时，处理5 min后，幼虫大量死亡，存活的幼虫极少。100 W超声波分别处理3 min、5 min、7 min不同的时间，诱导后48 h提取的血淋巴，对溶壁微球菌均有明显的抑菌效果，处理5 min和7 min的抑菌效果均较好，但超声波100 W处理7 min后，幼虫死亡也增多，不宜采用。经100 W超声波处理5 min，于诱导后24 h、48 h、72 h不同时间提取的血淋巴，对溶壁微球菌均有明显的抑菌效果，尤其诱导后48 h、72 h提取的血淋巴有较好的抑菌效果，但随时间的延长，幼虫死亡增多，且72 h后存活的幼虫开始大量化蛹，不易收集到大量的幼虫以供实验之需，由此可见诱导后收集血淋巴以48 h为宜。
作者对丝光绿蝇抗菌肽的研究曾采用针刺体壁诱导，效果较好，但每虫1针较费时间，超声波可1次大量诱导，进一步的研究正在进行中。
【参考文献】
[1] 许兵红，曾莉萍，艾予川，等.丝光绿绳抗菌物质的诱导[J].中国寄生虫病防治杂志，2004，17(2):75-77.
[2] 许兵红，曾莉萍，艾予川，等.丝光绿蝇抗菌物质针刺诱导及其性质研究[J].中国人兽共患病杂志，2004,20(6):526-528.
[3] 许兵红，曾莉萍，赵春澎，等.丝光绿蝇抗菌肽热稳定性研究[J].中国媒介生物学及控制杂志，2005,16(4):254-267.
