改良组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

　　作者：王倩,舒茂琴,江明宏,李建涛,康振峻　　作者单位：1.第三军医大学附属西南医院心血管内科，重庆 ;2.解放军第252医院心血管内科，河北 保定

　　【摘要】 目的 以简捷、高效的方法获取原代和传代的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)，为进一步的科学研究提供实验材料。方法 采用改良的组织块贴壁法培养原代大鼠VSMC，2.5 g•L-1胰蛋白酶消化传代，并用相差显微镜、电镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对细胞进行鉴定。结果 95%的组织块接种成活，相差显微镜下细胞呈典型的“峰-谷”状生长，胞体长梭形;电镜下可见粗、细肌丝沿细胞长轴平行排列;荧光显微镜及激光共聚焦显微镜检测α肌动蛋白可见细胞胞浆内呈阳性显色，细胞核不显色。结论 本方法培养VSMC简便、易操作，获得的细胞纯度和成活率较高。

　　【关键词】 大鼠;血管平滑肌细胞;细胞培养;主动脉

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30470727)

　　Culture and identification of rat′s vascular smooth muscle cells with modified tissuepiece inoculation　　WANG Qian,SHU Maoqin，JIANG Minghong，et al　　1.Department of Cardiology，Southwest Affiliated Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing 400038,China;　　2.Department of Cardiology,the 252nd Hospital of People′s Liberation Army,Hebei 071000,China Abstract: Objective To obtain vascular smooth muscle cells of original generation and passage of rat in simple and effective way for the related researches.Methods The original generation cells were obtained by modified tissuepiece inoculation and with 0.25% trypsin digestion to obtain passage cells.The cells were identified by contrast phase microscope,electron microscope,fluorescence microscope and confocal microscopy.Results 95% inoculated tissue pieces were survived.Under contrast phase microscope,cells showed the typical “peak valley” morphological,cell bodies were fusiform shape.Under electron microscope thick myofilament and thin filament ranged parallelly along cell macroaxis.Under fluorescence microscope and confocal microscopy,endochylema of αactin was been seen that it was stained positive.And the nucelus wasn′t been stained.Conclusion It is a simple and easy way to obtain highly purified VSMC and the survival rate is high.

　　Key words: rat;vascular smooth muscle cells;cell culture;aorta

　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分之一。近年来，随着分子生物学和细胞生物学研究的进展，人们对VSMC表型的可塑性、增殖、迁移、分化、凋亡和细胞外基质的合成与分泌等方面的认识不断深化[1]。目前认为，VSMC从血管中膜迁移到内膜、增殖并分泌大量的细胞外基质而使内膜增生是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等病理过程发生的主要机制[2]。因此，获得良好生长状态的离体VSMC是研究其生物学行为的基础。作者采用改良的组织块贴壁法、胰蛋白酶消化法获得原代和传代的细胞，并用相差显微镜、电镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对细胞进行鉴定，成功培养出大量生长状态良好的VSMC。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　SD(Sprague Dawley)大鼠，体质量120～150 g，雌雄不拘，购自第三军医大学动物所;DMEM(高糖型)培养基、胰蛋白酶粉，均购自HyClone公司;标准胎牛血清，购自杭州四季青公司;小鼠抗大鼠α肌动蛋白(αactin)单克隆抗体，羊抗小鼠TRITCIgG抗体，均购自天津津脉公司;封闭用正常羊血清，PBS粉剂，均购自北京中杉公司;24孔板，10 mm×10 mm盖玻片，25 cm2塑料培养瓶(Costar公司)及手术器材。

　　1.2 细胞培养

　　1.2.1 原代培养

　　大鼠用10 g•L-1戊巴比妥按1 mL•100 g-1体质量腹腔注射麻醉，固定在超净工作台上，仰卧。用0.78 mol•L-1硫化钠脱毛，碘伏充分消毒皮肤。沿腹中线剖开胸腔、腹腔，剪开膈肌，翻开左侧肺叶，可见在脊柱前走行的胸主动脉。小心分离取出主动脉放在洁净的平皿中，加入含体积分数20%标准胎牛血清的培养基，反复冲洗去除血污。用2把眼科镊轻轻夹住血管向相反的方向稍用力牵拉，呈袖套样剥除外膜。更换平皿，清洗血管。固定血管一端，用眼科剪纵行剖开血管。将血管铺开，内膜面向上，用棉签刮去血管内膜及血迹、脂肪滴等杂质，再次用培养基冲洗。此时可见血管中膜为白色，有一定的韧度。血管中膜的主要成分为VSMC，将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，边缘整齐、光滑，均匀贴放于25 cm2培养瓶底面，间隔约5 mm，向培养瓶内加入约4 mL含体积分数20%胎牛血清的培养基(注意勿接触组织块)，并滴2～3滴于组织块上，使其保持湿润。将培养瓶细胞面向上，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，稍微松开瓶口(使CO2能够进入瓶中)。静置1.5～3 h，轻轻翻转培养瓶使组织块浸没在培养基中，继续培养。静置3 d后视细胞状态给予换液，待细胞生长至约90%融合时给予传代。

　　1.2.2 细胞换液

　　在超净工作台上，吸弃原培养基，用PBS轻轻冲洗后，加入新鲜的含体积分数20%胎牛血清的培养基继续培养。动作应轻柔，尽量不要碰到组织块。周期约为2～3 d。

　　1.2.3 细胞传代

　　在超净工作台上，小心吸弃原培养基，加入PBS 2 mL轻晃培养瓶冲洗细胞，吸弃，加入2.5 g•L-1胰蛋白酶2 mL，37 ℃消化约40 s。倒置显微镜下见细胞回缩、变圆、折光性增强，立即吸弃胰蛋白酶。加入PBS 4 mL冲洗残余胰蛋白酶，吸弃。加入含体积分数10%胎牛血清的培养基4 mL终止消化。盖好瓶盖，用拇指大鱼际对称拍打培养瓶侧壁，使大部分细胞脱落，然后轻轻吹打瓶壁细胞使其完全脱落，形成的细胞悬液按12或13接种。周期约为5～7 d。首次传代时，脱落的组织块可以转移到新的25 cm2培养瓶中，按原代培养的方法使组织块重新贴壁。

　　1.3 细胞鉴定

　　1.3.1 形态学鉴定

　　1.3.1.1 倒置显微镜

　　观察VSMC大体形态、大小、折光性、生长特点和排列方式等。

　　1.3.1.2 电镜鉴定

　　取第3代至第5代处于对数生长期的细胞，弃去原培养液，PBS洗2遍，以2.5 g•L-1胰蛋白酶使细胞消化离壁，收集细胞悬液于离心管中，1 000 r•min-1离心5 min,弃上清，收集底部约大米粒大小的细胞。加入4 ℃预冷的体积分数2%戊二醛固定2 h，按常规方法行组织包埋、切片，在透射电镜下观察细胞的形态、大小、细胞器、肌丝等特征。

　　1.3.2 细胞表型标志物鉴定

　　免疫细胞化学法：按照电镜鉴定项中的方法收集细胞，用含体积分数10%胎牛血清的培养基制成细胞悬液(约2×104•mL-1)，接种到预先放置10 mm×10 mm盖玻片的24孔板中，每孔50 μL，补充培养基使其覆盖整个孔底，静置培养2～3 d。待细胞80%～90%融合，取出盖玻片，用37 ℃ PBS 漂洗5 min×3次，体积分数4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。加入体积分数0.1%的TritonX100孵育15 min以增加细胞膜的抗原通透性，PBS漂洗5 min×3次。加入体积分数5%正常羊血清于湿盒中封闭1 h，擦去多余血清。加入小鼠抗大鼠αactin单克隆抗体(130)，4 ℃冰箱中过夜(>18 h)。加入羊抗小鼠TRITCIgG抗体(150)静置孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，体积分数95%甘油封片，荧光显微镜下观察。在激光共聚焦显微镜下观察时，二抗用绿色荧光标记的羊抗小鼠FITCIgG抗体(150)，其他步骤与前相同。

　　2 结果

　　2.1 细胞培养

　　原代培养4～7 d，95%的组织块周围有细胞游出，少数组织块需继续培养至2～3周。镜下见细胞以垂直方向从组织块边缘游出，向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇(图1,右下是组织块)。细胞形态多样，呈长梭形、三角形或不规则形等，折光性强，有长短不一的胞突，胞浆丰富，胞核卵圆形，居中，部分可见双核，甚至多核。细胞密度低时常交织呈网状，密度高时则呈漩涡状或者栅栏状，呈典型的“峰-谷”状生长，见图2。传代8代以内的细胞大部分生长状态良好，生长方式和形态特点同前一致。

　　2.2 细胞鉴定

　　2.2.1 形态学观察

　　倒置显微镜下见平滑肌细胞呈长梭形、三角形或不规则形，有多个胞突，胞浆丰富，胞质密度高、不透明。胞核卵圆形，居中，部分可见双核，甚至多核。有多个核仁。细胞密度高时呈现典型的“峰-谷”状，见图2。

　　2.2.2 电镜观察

　　在电子显微镜下观察，可见胞浆内有丰富细胞器，肌丝沿细胞长轴排列，有密区，是平滑肌细胞的典型特征，见图3。

　　2.2.3 免疫细胞化学法检测

　　荧光显微镜下可见，胞体长梭形，胞浆红色，呈阳性反应。高倍镜下见胞浆内大量与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝，见图4。

　　2.2.4 激光共聚焦显微镜观察

　　在激光共聚焦显微镜下可见，VSMC胞体长梭形，胞浆绿色，呈阳性反应。胞核不着色，圆形或卵圆形，居中，见图5。

　　3 讨论

　　VSMC是冠状动脉粥样硬化和介入术后血管再狭窄等心血管病变中的主要细胞成分之一，受多种因素调节，各种细胞因子和信号途径相互作用，协调细胞生理及病理状态下的表达和功能[3]。细胞培养方法的建立为研究VSMC提供了稳定可靠的方法学，也对了解其特性和分化规则，寻找血管疾病的病因和防治方法起到重要作用[4]。

　　目前，原代培养VSMC的方法主要有2种：胶原酶消化培养法和组织块贴壁法。前者所需时间较短，产量高，但胶原酶价格昂贵，且试验中污染机会大，最佳消化时间不好把握，易消化过度导致细胞活力不佳。相比较而言，后者培养大鼠VSMC更为简便、经济、有效，但所需时间较长(4～7 d)[5]。在培养过程中，作者有以下体会：(1)选择血管供体时，一般选用体质量120～150 g的大鼠;体质量太小，血管细，操作困难;体质量太大则细胞活力弱，不易生长。(2)取材及培养过程中，严格无菌，动作快捷、准确，减少污染机会。(3)剥除血管外膜和内膜时，动作轻柔，避免用力牵扯，使细胞受伤，活力下降，导致细胞生长缓慢或不生长。(4)组织块干涸贴壁后及时翻正培养瓶，时间约为1.5～3 h。干涸时间短有利于细胞存活，但不利于贴壁;干涸时间长则相反。(5)漂起的组织块及时清理，可将漂起的组织块转移到新的培养瓶中重新贴壁，继续培养。(6)组织块大小以1 mm3较为合适，边缘整齐、光滑，以利于细胞游出。组织块间距5 mm，以保证细胞游出后有足够的生长空间并保持细胞密度的均匀。(7)免疫细胞化学法鉴定时,若显色不好,可以将透膜剂(如体积分数0.1%Triton X100)与抗体一起温育,有利于抗体透过胞膜和核膜，与抗原充分结合。(8)细胞传代时，吹打对细胞活力的伤害较大，作者采用拇指大鱼际对称拍打培养瓶侧壁，利用培养液对细胞的冲击使细胞脱壁，较吹打柔和更有利于细胞的成活。本方法成功地培养出VSMC，为进一步研究其生物学行为、相关疾病发病机制及防治提供了实验材料。

　　【参考文献】

　　[1]温进坤，韩 梅.血管平滑肌细胞[M].北京：科学出版社，2005：5.

　　[2]廖 华，糜 涛，郭小梅.血管平滑肌细胞增殖信号转导通路与血管再狭窄防治[J].医药导报，2007，26(2)：116121.

　　[3]何维来，陈如坤.血管平滑肌细胞迁移、增殖致冠状动脉搭桥术后再狭窄分子机制的研究进展[J].微循环学，2006，16(2)：6267.

　　[4]刘红梅，黄体钢.血管平滑肌细胞的培养及其在血管疾病研究中的应用[J].实用心脑肺血管病杂志，2005，13(6)：364369.

　　[5]张 量，隋 璐，孙成林，等.组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征[J].中国临床康复，2005，9(19)：108111.