高血压病的基因治疗

　　作者：陈奎　　作者单位：安徽省蚌埠市第三人民医院 干部病房，233000

　　【关键词】 高血压 基因治疗 综述文献

　　高血压是严重危害人体健康和生活质量的疾病，是心肌梗死、心力衰竭、脑卒中、终末期肾病和外周血管疾病的最重要高危因素之一。目前高血压病患者在中国有1亿多例，并有继续增长的趋势[1]。临床用于治疗和控制高血压的药物种类较多，但其控制效果不尽如人意。因此寻求新的高血压治疗方法和策略就显得十分必要和迫切。随着分子生物学技术的发展，高血压的基因治疗就自然而然地成为当前研究的热点。本文就高血压病的基因治疗研究进展综述如下。

　　1 基因治疗的基本理论

　　1.1 基因治疗的概念

　　基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中，以补充缺失基因或置换致病基因，从而产生新的表型的一种治疗方法。基因治疗必须具备目的基因、靶细胞以及将目的基因导入靶细胞的转基因方法。同时，目的基因的表达及对此表达的调控亦是不可缺少的重要条件。基因治疗最初用于某些先天性缺陷病，现已广泛应用于AIDS、恶性肿瘤、心血管病等。

　　1.2 目前高血压基因治疗的策略主要有

　　(1)采取质粒DNA直接导入或经病毒载体介导技术，增加舒血物质的生物。(2)采取反义寡核苷酸直接导入或经病毒载体介入，阻断缩血管物质的生成。目前在阻断缩血管物质生成方面，基因治疗的靶基因主要针对RAS系统的某些成分，如AGT和AT1基因。在增加舒血管物质生成方面，靶基因主要涉及心钠素、激肽释放酶、一氧化氮合酶、肾上腺髓质降压素和降钙素基因相关肽等。

　　2 基因治疗高血压的方法

　　2.1 激肽释放酶基因疗法

　　激肽释放酶(kallikrein)是体内的一类蛋白酶，可使某些蛋白质底物激肽原分解为缓激肽。缓激肽具有舒张血管活性，可参与对血压和局部组织血流的调节。在人体和动物实验中证实，缓激肽是目前已知的最强的舒血管物质之一。Eric等[2]给予DOCAsalt高血压大鼠模型静脉注射以腺病毒为载体的人组织激肽释放酶基因后，延迟BP升高时间达2 d，并且降压作用持续约23 d。与注射以腺病毒为载体的虫荧光素酶基因的对照组比较，注射人组织激肽释放酶基因的大鼠的最大降压幅度可达50 mm Hg，最小降压幅度也可达32 mmHg，并持续于整个实验期间。同时人组织激肽释放酶基因转染后，DOCAsalt高血压大鼠的尿量、尿蛋白水平和体重均降低。肾形态学检测显示肾小球硬化、肾小管扩张、蛋白管型等现象明显减轻。Costanza等[3]以腺病毒为载体，将人组织激肽释放酶基因肌内注射转染自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)后，结果显示人组织激肽释放酶基因可以促进BP正常的动物自发性代偿血管生成，特别重要的是能纠正SHR的血管再生缺陷。

　　2.2 肾上腺髓质素基因疗法 肾上腺髓质素

　　(adrenomedulin,ADM)是由日本学者从切除的嗜铬细胞瘤组织提取液中分离提纯的一种多肽[4]，由52个氨基酸组成人类的肾上腺髓质素，在体内具有舒张血管、促尿钠排泄和强心等作用。Chao等[5]将携带有人的ADM基因的腺病毒载体通过静脉注射到Dahl盐敏感性高血压大鼠(Dahl saltsenstive rat)，结果发现转染基因约4 d后BP降低，第11天时BP下降幅度最大，达24 mm Hg。同样在DOCAsalt大鼠可观察到，注射ADM基因载体约3 d后BP大幅度降低，与注射虫荧光素酶基因的对照组比较，约在9 d时最大差距达41 mm Hg。另外在DOCAsalt大鼠和两肾夹高血压大鼠的动物模型中，注射ADM基因载体后降压作用均持续数周。同时，在治疗组动物中观察到，左室肥厚程度降低，尿蛋白排泄减少，尿中的cAMP水平升高，肾小球滤过率和肾血流量增加。形态学结果显示，ADM基因转染的大鼠心肌细胞直径减小，间质纤维化程度降低，肾小球硬化、肾小管损伤和肾细胞的增殖均降低。这些研究成果显示ADM将可能在心血管疾病和肾损伤的治疗应用中起到很大的作用。

　　2.3 抗血管紧张素原基因疗法

　　在目前已研究过的高血压(EH)候选基因中，血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因被认为最有可能成为EH相关基因。人AGT基因位于染色体1 q 42～43。应用受累同胞对进行连锁分析，发现AGT基因与EH有明显连锁关系，多数报道证实，该基因的M235T变异体与高血压相关联，血浆AGT水平依次为TT>TM>MM基因型。最后一项研究表明，TT、TM型的收缩压和舒张压及血浆AGT浓度均显著高于MM型患者，此外，前者用降压药比例及用二种以上降压药的比例均显著高于后者。还有人报道，T235基因型高血压患者对血管紧张素转换酶抑制剂(AGEI)降压反应较为敏感。肾素血管紧张素系统(RAS)在血压的调节和高血压病的发生、发展中起着重要作用。AGT是RAS中唯一能产生血管紧张素I(Ang I)的底物。Tomits等[6]将他们所构建的抗AGT的反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODNs)用含有病毒凝集素的脂质体包裹后经门静脉注入自发性高血压鼠(SHR)体内，使之与肝细胞融合传染SHR的肝脏，结果引起SHR的血浆AGT水平暂时降低，并伴随SHR肝脏AGTmRNA的降低，血浆AngⅡ浓度降低和血压暂时下降。注入反义ODNs后，SHR的血压从178 mmHg降压154 mmHg维持时间约1周。反义ODNs降压作用不能持久，如何延长降压作用时间也是今后研究的主要方向。

　　2.4 抗血管紧张素Ⅱ受体基因疗法

　　Gyurko、Phillips、Ambuhl等[7]用血管紧张素Ⅱ受体亚型1(AR1R)成功降低SHR的血压。其方法是将抗AT1受体mRNA的反义寡核苷酸注入SHR脑室内，然后测定AT1受体和血管紧张素Ⅱ受体亚型2(AT-2)受体的数目的，并监测鼠的血压。结果显示：SHR丘脑下组织块中AT受体数目减少20%～30%，SHR血压明显下降，降压幅度可达49 mmHg，而且也能显著降低SHR由血管紧张素Ⅱ所诱发的饮水反应。上述结果为抗血管紧张素Ⅱ受体基因治疗高血压病提供了可靠的依据。

　　2.5 高血压反义基因疗法

　　高血压反义基因治疗是用相应反义寡脱氧核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)或重组于表达载体上的反义核片段(如AScDNA)对引起血管收缩和高血压的过分表达的基因采取反义抑制或封闭，抑制复制、转录、转录后mRNA加工运输和翻译过程，从而抑制引起高血压的活性蛋白质(如血管紧张素Ⅱ[angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ])的产生，降低血压并逆转与高血压有关的病理生理和形态学改变(如血管重建、心肌重构)。Gyurko、Phillips、Ambuhl[7]等先后于1993～1995年报道针对AngⅡ1型受体(angiotensin type 1 receptor,AT1R)或AGT的ASODN能成功降低自发性高血压大鼠(SHR)的高血压。此后，反义基因治疗高血压成为研究热点之一。临床试验已经证明，RAS的抑制是治疗高血压的重要途径，已有4种反义成分用于高血压的治疗研究[6～12]：反义AT1R(ASAT1)、反义AGT(ASAGT)、反义血管紧张素转换酶(angiotensin Ⅱconverting enzyme antisense,ASACE)和反义β1-肾上腺素能受体(bataladrenergic receptor antisense,ASβ1)。不同的反义成分有不同的生物学效应和降压效果，同样的反义成分因其有无载体以及载体的种类或进入体内的途径不同，其降压效果以及对病理生理和形态学改变的改善程度是不一样的。但绝大多数文献报道已显示出了反义基因治疗的优越性：一次注射反义成分能长期降血压或延缓高血压的发生，并能预防或逆转与高血压有关的病理生理和形态学变化，且选择性高，不出现传统药物的副作用。针对同一个靶基因或其mRNA的反义核酸中AScDNA比ASODN作用时间长，病毒载体介导的AScDNA一次注射降血压25～38 mm Hg达3～7个月[10，11，13]，裸ASODN直接脑室或心内注射降血压16～50 mm Hg仅1～3 d[14]，硫代修饰或脂质体介导的ASODN降血压时间延长到3～7 d居多[15]。病毒载体介导的AT1AScDNA能在心、肾、肾上腺和肠系膜动脉高表达，AT1R密度减低，使AngⅡ致主动脉收缩和升压反应减低[15]，AngⅡ致渴反应和升压反应减低80 d，并能预防和逆转心肌肥大及心内膜下心肌纤维化[10，13]，使子代肾动脉兴奋-收缩耦联正常[14]。腺相关病毒(AAV)载体能使AT1AScDNA整合于基因组。β1ASODN与β1受体阻滞剂相比具高度专一性，Phillips等报道β1ASODN使SHR心脏β1AR密度下降30%～50%持续18 d，对脑β12R无影响，对β2AR也无影响，因此对心率无影响，也不会出现中枢神经系统副作用[10]。总之，应用病毒载体介导的反义AT1受体基因治疗，能够防止高血压的发生和进展，从而能够早期干预以阻止高血压的发生、发展[14]。现有的资料表明，反义基因治疗乃是将来控制人类高血压的一个有效的方法。

　　2.6 心房利尿肽基因疗法

　　心房利尿肽(atrial natruretic peptids,ANP)是在20世纪80年代以来被发现的一族活性肽，人体中最主要的是含28个氨基酸构成的多肽。ANP主要是由心房肌细胞合成和释放，通过舒张血管，降低外周阻力，增加肾小球滤过率，抑制肾素的释放，引起明显的尿钠和尿量增加等作用机制，达到降低BP的效果。Lin等[15]给Dahl盐敏感性高血压脑卒中大鼠静脉注射以腺病毒为载体的ANP基因，平均血压可大幅度降低，作用可维持1 min，脑卒中的死亡率可从54%下降至17%，心肌肥厚和血管肥厚明显减轻。李涛等[16]将人ANP基因的逆转录病毒表达重组体和未携带ANP基因的逆转录病毒空载体pLNCX分别导入SHR新生鼠的皮肤成纤维细胞中，然后将表达和不表达ANP的新生鼠皮肤成纤维细胞分别装入不同的微孔胶囊中，封闭后分别植于实验组和对照组幼龄SHR的皮下。试验观察到，2组大鼠的BP虽然随个体发育而逐渐升高，但实验组BP却始终低于对照组，其中2 W时的BP差异达28 mm Hg。同时，实验组大鼠的尿量在2、3 W时均明显多于对照组。该研究结果表明，心房利尿肽基因表达细胞胶囊的皮下移植可以产生明显的降压、利尿效应，交且胶囊可以随时取出，从而在一定程度上提高了基因治疗的实用性。

　　2.7 一氧化氮合酶基因疗法

　　一氧化氮(NO)在调节机体血压和局部血循环，抑制血小板聚集和内皮细胞、血管平滑肌细胞的增生增殖中都有重要作用。汪培华等[17]用新的真核表达载体pcDNA携带人eNOS基因导入果糖诱导的高血压大鼠体内，第3天时BP明显下降，最大降压效应在导入基因后第14天，并且持续3 W以上;同时可以明显改善果糖诱导的高胰岛素血症，从而有希望通过降低血压和改善胰岛素抵抗达到防止器官损害的作用。Marie等[18]发现，eNOS基因的第7个外显子上的密码子894G被T所置换，可以造成肽链298位上的谷氨酸(Glu)碱基被天冬氨酸(Asp)碱基所代替。与血压正常的对照组比较，高血压组和高血压抵抗组患者的T等位基因出现的频率都较高(分别是P=0.022和0.046)。提示eNOS 基因的298位Glu/Asp的多态性可能与原发性高血压的复杂发病机制有关，也可能是影响原发性高血压患者对传统药物产生耐受的一个重要因素。另外，Alexander等[19]实验证实以腺病毒为载体将人eNOS基因通过颈动脉注射后，可以改善原发性高血压脑卒中倾向大鼠的NO生物利用缺陷，恢复颈动脉的内皮功能，而超氧化物歧化酶(CuZsuperoxide dismutase,Cu-ZnSOD)则无此效应[20]。从而为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病的研究提供了一条新途径。

　　3 存在问题及展望

　　大量实验资料显示高血压的基因治疗有着令人鼓舞的前景，但是目前高血压病的基因疗法尚处于临床前的动物实验阶段，有许多问题仍然需要我们去克服和解决，目前主要存在的问题是：(1)靶基因的界定。是高血压病治疗的前提，只有对高血压病的分子生物学机制有了透彻的了解，明确了发病的关键基因和相关基因，才有可能从基因水平诊治高血压病，而且高血压病是多基因异常疾病，这就给对给靶基因的界定和选择带来了一定困难。(2)载体构建。构建安全、高效、免疫原性低的载体是基因治疗一大热点。(3)基因转移法。建立安全有效的基因导入方法也很关键，一般而言，直接基因转移法优于间接法。随着分子生物学和分子病理学理论与技术的发展，随着基因治疗整体水平的不断提高，我们相信基因治疗定能成为高血压病治疗的最佳有效途径之一。

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