吴茱萸碱对人胃癌SGC7901细胞增殖、侵袭和保罗样激酶1基因表达的影响
发表时间：2011-12-29 浏览次数：446次
程兆明1， 周永静2， 张尤历1， 祁卫东2， 范钰2 (1.江苏大学附属医院消化内科， 江苏 镇江 212001; 2.江苏大学附属人民医院肿瘤研究所， 江苏 镇江 212002)
[摘 要] 目的：观察中草药提取物吴茱萸碱(evodiamine)对人胃癌细胞侵袭的影响及可能的机制。方法：采用不同浓度的吴茱萸碱处理人胃癌SGC7901细胞后，以软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖，以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力;分别以荧光实时定量RTPCR和免疫荧光方法检测癌细胞保罗样激酶1(pololike kinase 1，PLK1)基因表达水平。结果：胃癌SGC7901细胞经吴茱萸碱处理后，恶性增殖和穿膜细胞数均明显下降，且呈剂量依赖性(P<0.05)。吴茱萸碱处理组PLK1 mRNA和蛋白水平均明显下调，且呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。结论：吴茱萸碱可明显抑制胃癌细胞侵袭力，其机制可能与下调PLK1基因表达有关。
[关键词] 胃肿瘤; 吴茱萸碱; 侵袭; 保罗样激酶1
[Abstract] Objective:To study the effects and mechanism of evodiamine on human gastric cancer cell.Methods:After human gastric cancer SGC7901 cell were treated with different doses of evodiamine， the growth of anchorage independence of cancer cell was studied by colony formation in soft agar. Invasion ability were determined by Boyden chamber，and the level of mRNA and protein of pololike kinase 1(PLK1)gene were detected by real time RTPCR and immumoflurescence method respectively.Results: Evodiamine could significantly inhibit both invasion ability and anchorage independence growth in dosedependent manners.The level of mRNA and protein of PLK1 of cancer cells treated with evodiamine reduced in timeand dosedependent manners.Conclusion:Evodiamine could inhibit invasion of human gastric carcinoma cell through downregulating of PLK1 expression.
[Key words] gastric carcinoma; evodiamine; invasion; pololike kinase 1
胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，在全世界恶性肿瘤发病率中位居第二位，日本、智利、芬兰等国多发。我国胃癌的发病率也较高，约占整个消化道恶性肿瘤的50%。中草药治疗胃癌是我国胃癌治疗的一大特色，适用于胃癌治疗的各个阶段，并可与手术、放化疗等联合使用。但大部分中草药抗癌分子机制尚不完全清楚。
吴茱萸为芸香科植物中药吴茱萸干燥近成熟果实，近代医学发现吴茱萸具有镇痛安神、抗菌、降压等药理作用。吴茱萸碱(evodiamine)是从中草药吴茱萸中提取的单一成分。许多学者发现，吴茱萸碱可抑制许多癌细胞如前列腺癌、宫颈癌、黑色素瘤等癌细胞增殖[1-5]，提示吴茱萸碱具有一定的抗癌作用，但有关吴茱萸碱对胃癌等消化道肿瘤的影响研究甚少。
本研究以吴茱萸碱处理人胃癌SGC7901细胞，观察其对癌细胞增殖、侵袭的影响，并以保罗样激酶1(pololike kinase 1，PLK1)基因为靶点，探索可能的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材 料
吴茱萸碱购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)配成储液，-20 ℃冰箱保存。试验时用RPMI 1640培养基稀释，DMSO的最终浓度小于0.01%(该浓度对胃癌细胞无分化诱导作用及细胞毒作用)。人胃癌细胞株SGC7901购自美国ATCC细胞库，江苏大学附属人民医院组织细胞生物库冻存。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。PLK1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 细胞培养
人胃癌SGC7901细胞在含10%新生小牛血清的RPMI 1640液中培养，置37 °C，50 ml/L CO2培养箱中。每日观察，待细胞至对数生长期，采用不同浓度(2.5，5，10 μmol/L)的吴茱萸碱处理，然后准备进行以下试验。
1.3 锚着不依赖性增殖检测
采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖，具体操作按照文献[6]方法进行。1.4 体外侵袭抑制试验
该试验在改良的Boyden 小室中操作，按照文献[6]方法进行。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理。
1.5 PLK1基因mRNA水平检测
分别采用不同剂量的吴茱萸碱处理胃癌SGC7901细胞24、48、72 h后，收集各组细胞，用Trizol提取RNA，并进行cDNA合成。荧光实时定量PCR PLK1引物：上游，5′CAAGCTCATCTTGTGCCCACT3′;下游，5′GAGAAAGGGCTGCCAGGC3′。FAM探针引物5′CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG3′TAMRA。以3磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) mRNA为内参。根据文献[7]方法，采用荧光实时定量RTPCR检测PLK1基因mRNA水平。
1.6 免疫荧光法检测PLK1蛋白水平
将胃癌SGC7901细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，细胞和盖玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加PLK1单克隆抗体(1∶1 000)覆盖整个切片，4 ℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗，37 ℃保温30 min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封固。在荧光显微镜下观察，拍照，荧光强度扫描。
1.7 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理，所得到的计量资料均以x±s表示，行正态性D检验，对双变量相关分析采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 吴茱萸碱对胃癌SGC7901细胞软琼脂集落形成的影响
胃癌SGC7901细胞在体外半固体培养体系中可自发地形成集落，而经不同浓度的吴茱萸碱处理后，所形成的集落数明显减少，且呈剂量依赖性(r=0.908，P<0.05)。
2.2 吴茱萸碱对胃癌SGC7901细胞侵袭的影响
收集经吴茱萸碱处理的细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，吴茱萸碱处理组癌细胞穿过滤膜的细胞数明显下降，经统计学处理，下降呈浓度依赖性(r=0.921，P<0.01)。
2.3 吴茱萸碱对胃癌细胞PLK1基因表达的影响
以吴茱萸碱处理细胞后，于不同时间收集细胞，分别采用荧光实时定量RTPCR和免疫荧光方法检测。结果发现，与对照组比较，处理组PLK1 mRNA和蛋白水平明显降低(r=0.915，P<0.001;r=0.939， P<0.001)。
3 讨 论
正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多需黏附于特定的细胞外基质上存活，称为锚着依赖性(anchorage dependence)。一般认为，肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着不依赖性增殖的特性，且与其恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多[8]。本试验结果发现，人胃癌SGC7901细胞经不同浓度的吴茱萸碱处理后，与空白对照组比较，软琼脂集落数呈浓度依赖性减少(P<0.05)。
肿瘤细胞侵袭转移是一个复杂、多步骤的级联过程，包括：① 首先从原发肿瘤上脱落;② 破坏并穿过自身基质;③ 穿入脉管(血管或淋巴管)进入血液循环或淋巴系统，并在其中存活;④ 形成瘤栓停滞于小脉管;⑤ 黏附于脉管内皮细胞，分泌蛋白酶水解内皮下基膜，迁移并穿出脉管;⑥ 在远处组织、器官中增殖，形成远处转移。在此过程中，癌细胞侵袭细胞外基质是重要的步骤。本研究采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭能力。该模型所用的基质胶(matrigel)含有Ⅳ型胶原、层黏蛋白、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素蛋白多糖等成分，与细胞外基质的成分非常相近。因此，该法能有效地在体外模拟肿瘤细胞的侵袭过程。本研究体外侵袭试验结果发现，吴茱萸碱可明显抑制癌细胞的侵袭力，且呈浓度依赖性(P<0.01)。
保罗样(Polo)激酶家族包括人PLK1，Snk，Fnk，Xenopus laevis Plx1，果蝇Drosophila polo，酵母Plo1和出芽酵母Cdc5[9]。在低级动物中，该家族成员能控制中心小体功能、染色体分离和胞值移动[9-10]。PLK1是哺乳类该基因家族的重要成员之一。研究发现，PLK1在有丝分裂指数增高的细胞和组织(如恶性肿瘤)中表达增高[11-14]。既往研究大部分集中于PLK1基因与肿瘤细胞凋亡的关系方面[15]。最近有许多学者采用免疫组化方法研究发现，PLK1基因与某些恶性肿瘤如肝癌、大肠癌和胃癌细胞侵袭有关，且PLK1高表达与患者不良预后有关[16-18]。本试验结果发现，吴茱萸碱抑制胃癌SGC7901细胞侵袭的同时，PLK1 mRNA和蛋白水平下降，且呈时间和浓度依赖性(P<0.001)。
由此，PLK1基因在人胃癌SGC7901细胞侵袭方面可能起着重要的作用;吴茱萸碱可明显抑制胃癌细胞体外恶性增殖和侵袭能力，其机制可能与下调PLK1基因表达有关。
[参考文献]
[1] Fei XF， Wang BX， Li TJ，et al. Evodiamine， a constituent of Evodiae Fructus， induces antiproliferating effects in tumor cells[J]. Cancer Sci，2003，94(1):92-98.
[2] Chen MC， Yu CH， Wang SW， et al. Antiproliferative effects of evodiamine on human thyroid cancer cell line ARO[J]. J Cell Biochem，2010，110(6):1495-1503.
[3] Liao CH， Pan SL， Guh JH，et al. Antitumor mechanism of evodiamine， a constituent from Chinese herb Evodiae fructus， in human multipledrug resistant breast cancer NCI/ADRRES cells in vitro and in vivo[J]. Carcinogenesis，2005，26(5):968-975.
[4] Huang DM， Guh JH， Huang YT， et al. Induction of mitotic arrest and apoptosis in human prostate cancer pc3 cells by evodiamine[J]. J Urol，2005，173(1):256-261.
[5] Ogasawara M， Matsubara T， Suzuki H. Inhibitory effects of evodiamine on in vitro invasion and experimental lung metastasis of murine colon cancer cells[J].Biol Pharm Bull，2001，24(8):917-920.
[6] 范钰，郑树，丁佳逸. 脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性[J].中国病理生理杂志，2006，22(4)：761-765.
[7] Fan Y， Zhang YL， Wu Y， et al. Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells[J]. World J Gastroenterol，2008，14(3):428-434.
[8] Zhang J， Ren H， Yuan P，et al. Downregulation of hepatomaderived growth factor inhibits anchorageindependent growth and invasion of nonsmall cell lung cancer cells[J].Cancer Res，2006，66(1):18-23.
[9] Lane HA， Nigg EA. Cellcycle control: POLOlike kinases join the outer circle[J].Trends Cell Biol， 1997，7(2):63-68.
[10] Martin BT， Strebhardt K. Pololike kinase 1: target and regulator of transcriptional control[J]. Cell Cycle，2006，5(24):2881-2885.
[11] Winkles JA， Alberts GF. Differential regulation of pololike kinase 1， 2， 3 and 4 gene expression in mammalian cells and tissues[J]. Oncogene，2005，24(2):260-266.
[12] Takai N， Hamanaka R，Yoshimatsu J，et al.Pololike kinases (Plks) and cancer[J]. Oncogene，2005，24(2):287-291.
[13] van Vugt MA， Medema RH. Getting in and out of mitosis with Pololike kinase1[J].Oncogene，2005，24(17):2844-2859.
[14] Strebhardt K， Ullrich A. Targeting pololike kinase 1 for cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer，2006，6(4):321-330.
[15] Degenhardt Y， Lampkin T. Targeting pololike kinase in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res，2010，16(2):384-389.
[16] He ZL， Zheng H， Lin H， et al. Overexpression of pololike kinase1 predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients[J]. World J Gastroenterol，2009，15(33):4177-4182.
[17] Takahashi T， Sano B， Nagata T， et al. Pololike kinase 1 (PLK1) is overexpressed in primary colorectal cancers[J]. Cancer Sci，2003，94(2):148-152.
[18] 兰斌,刘炳亚,陈雪华，等.保罗样激酶1表达对胃癌的生物学行为及预后判定的意义[J].中华外科杂志，2007，10(1):70-72.
