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    《胸外科学》

    阿托伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素表达的影响

    发表时间：2009-06-27  浏览次数：791次

    作者:武宇洲,崔炜,李淑琴 作者单位：河北医科大学： 1第二医院，河北省心脑血管病研究所心内科， 2病理生理学教研室；3组织与胚胎学教研室，河北 石家庄 050000；基金项目：河北省教育厅基金(ZH2006004)            【摘要】  　　目的： 研究阿托伐他汀对醛固酮诱导大鼠心脏成纤维细胞（CFs）内皮素（ET）表达的影响. 方法： 以培养的新生SD大鼠CFs为实验模型，放免法检测CFs培养液中ET水平，流式细胞术测定CFs中的ET1含量，RTPCR测定内皮素1前体（ppET1）mRNA的表达. 结果： 醛固酮（1×10-7 mol/L）组CFs培养液中ET水平和CFs中的ET1含量及ppET1 mRNA的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；醛固酮（1×10-7 mol/L）+阿托伐他汀（1×10-6, 1×10-5, 1×10-4 mol/L）组明显低于醛固酮（1×10-7 mol/L）组，差异有统计学意义（P<0.01）；醛固酮（1×10-7 mol/L）+阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）+甲羟戊酸（1×10-3 mol/L）组明显高于醛固酮（1×10-7 mol/L）+阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P<0.01)，但和醛固酮（1×10-7 mol/L）组接近，差异无统计学意义(P>0.05). 结论： 阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的CFs ppET1 mRNA表达以及ET1的合成和分泌，其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关.

    【关键词】  醛固酮；内皮缩血管肽类；阿托伐他汀；心脏；成纤维细胞

    　　0 引言

    　　他汀类药物是胆固醇合成限速酶的抑制剂，近年来大量资料提示，此类药物除有调脂作用外，还有非调脂作用，在减轻心脏重塑中发挥着重要的作用. 我们以往的实验［1］发现心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs）可分泌内皮素（endothelin, ET），与心肌纤维化的发生、发展密切相关，推测阿托伐他汀有可能通过调节ET的表达参与了抗心肌纤维化过程. 因此，本实验旨在观察阿托伐他汀对醛固酮诱导新生SD大鼠CFs内皮素1前体（preproendothelin1, ppET1）mRNA表达以及ET1的合成和分泌的影响.

    　　1 材料和方法

    　　1.1 材料

    　　出生1～3 d的SD大鼠15只（河北医科大学动物中心）. 醛固酮、甲羟戊酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma公司）；DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；ET1多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；纤维连接蛋白mAb（Santa Cruz公司）. RT试剂、PCR试剂和DNA Marker（大连TaKaRa公司）；内皮素放免试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）. 阿托伐他汀（北京嘉林药业股份有限公司）.

    　　1.2 方法

    　　1.2.1 CFs的培养和鉴定

    　　取1～3 d龄SD大鼠在无菌条件下开胸剪取心室，用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得CFs［2］. 在50 mL/L CO2，37℃培养箱中孵育，待CFs生长接近融合时以1∶3传代，实验采用已传2～4代的CFs，SABC法免疫组织化学染色，纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的CFs.

    　　1.2.2 实验分组

    　　将CFs (2×105细胞/cm2)接种于24孔培养板和25 cm2的玻璃培养瓶中，待细胞生长至亚融合状态时，以10 g/L牛血清白蛋白培养液培养预适应24 h后，根据实验分组要求换用加入各种处理因素的10 g/L牛血清白蛋白培养液继续培养. 实验分组为正常对照组，醛固酮(1×10-7 mol/L)组，醛固酮(1×10-7 mol/L)+阿托伐他汀(1×10-6，1×10-5，1×10-4 mol/L)组和醛固酮(1×10-7 mol/L)+阿托伐他汀(1×10-4 mol/L) +甲羟戊酸(1×10-3 mol/L)组.

    　　1.2.3 CFs培养液中ET的水平应用放射免疫分析法，按照试剂盒说明书操作，测定CFs培养液中的ET水平.

    　　1.2.4 CFs中ET1的含量用胰蛋白酶EDTA消化、收集细胞，固定于4 ℃，700 mL/L乙醇中. 应用流式细胞术［3］，采用EpicsXLⅡ型流式细胞仪和Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析.

    　　1.2.5 CFs ET1 mRNA的表达

    　　提取细胞总RNA，进行逆转录反应.  PpET1引物［4］(上游5′AAC CAT GGA TTA TTT GCT CAT G3′,下游5′AGT GTT GAC CCA AAT GAT GTC3′)和GAPDH引物［5］(上游5′AAT GCA TCC TGC ACC AA3′,下游5′GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA3′)由北京塞百盛基因技术有限公司合成，可扩增出长度为230 bp的ppET1 cDNA片段和515 bp的GAPDH cDNA片段. PCR反应条件：ppET1：94℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸60 s；GAPDH：94℃变性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸90 s，32个循环. PCR产物于含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，用BIOPROFIF凝胶图像分析系统进行分析. 所有实验均重复3次. 　　统计学处理： 数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件对资料进行分析，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验. P<0.05为差异有统计学意义.

    　　2 结果

    　　2.1 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的CFs培养液中ET水平的影响醛固酮（1×10-7 mol/L）作用48 h，CFs培养液中ET水平较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，表1)；分别给予阿托伐他汀（1×10-6, 1×10-5, 1×10-4 mol/L）预处理CFs 24 h后，再加入醛固酮（1×10-7 mol/L）作用48 h，CFs培养液中ET水平呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；其中阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P>0.05) ；甲羟戊酸（1×10-3 mol/L）和阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）共同预处理CFs后，CFs培养液中ET水平明显高于阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P<0.01)，但和醛固酮组接近，差异无统计学意义(P>0.05). 表1不同条件下CFs ppET1 mRNA表达，ET1合成和分泌(略)

    　　2.2 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的CFs中ET1含量的影响醛固酮（1×10-7 mol/L）作用24 h，CFs中ET1含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01，表1)；分别给予阿托伐他汀（1×10-6, 1×10-5, 1×10-4 mol/L）预处理CFs 24 h后，再加入醛固酮（1×10-7 mol/L）作用24 h，CFs中ET1含量呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；其中阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P>0.05) ；甲羟戊酸（1×10-3 mol/L）和阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）共同预处理CFs后，CFs中ET1含量明显高于阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P<0.01)，但和醛固酮组接近，差异无统计学意义(P>0.05，图1）.

    2.3 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的CFs ppET1 mRNA表达的影响醛固酮（1×10-7 mol/L）作用4 h，CFs ppET1 mRNA的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01，表1)；分别给予阿托伐他汀（1×10-6, 1×10-5, 1×10-4 mol/L）预处理CFs 24 h后，再加入醛固酮（1×10-7 mol/L）作用4 h，CFs ppET1 mRNA的表达呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；其中阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P>0.05) ；甲羟戊酸（1×10-3 mol/L）和阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）共同预处理CFs后，CFs ppET1 mRNA的表达明显高于阿托伐他汀（1×10-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P<0.01)，但和醛固酮组接近，差异无统计学意义(P>0.05，图2）.

    　　3 讨论

    　　ET1在心脏局部及全身循环中起重要作用［6］. 近年来发现CFs能合成ET1并与心脏肥厚和心肌纤维化的发生、发展密切相关. CFs占心脏容积的0.25和心脏细胞总数的0.7，有证据表明CFs可能是心肌纤维化的主要效应细胞，也是他汀类药物的主要靶细胞［7-8］. 同时有研究［9］发现，他汀类药物在抗心脏重塑的过程中伴有心肌ppET1 mRNA和ET1水平的下降. 另外，一项临床研究［10］显示阿托伐他汀治疗可降低心力衰竭患者血浆ET1水平. 因此，推测阿托伐他汀可能是通过调节ET1的表达参与抗心肌纤维化过程的. 我们的结果显示，醛固酮能明显诱导CFs ppET1 mRNA表达、ET1的合成和释放，同时阿托伐他汀可显著抑制醛固酮的上述作用，表明阿托伐他汀减轻心肌纤维化的作用可能是通过其下调ET1水平介导的.

    　　他汀类药物的主要作用机制是通过竞争性抑制HMGCoA还原酶，在肝脏抑制胆固醇的合成，同时也阻断了甲羟戊酸和这一通路上其他重要的类异戊二烯中间体的生成［11］，抑制Ras和Rho等小分子GTP结合蛋白的类异戊二烯化修饰，导致胞质内非活性的小G蛋白堆积，阻断细胞内信号转导，从而具有多效性，即不仅具有调脂作用，还具有许多非调脂作用, 其所带来的临床益处已远远超过其调脂作用. 与此相一致的是，最近一些临床和动物实验研究发现他汀类药物可抑制心脏成纤维细胞增殖和胶原合成［7-8］，并且这种作用与甲羟戊酸代谢途径有关. 我们的结果发现，阿托伐他汀抑制醛固酮诱导CFs ppET1 mRNA表达、以及ET1合成和释放的作用可被外源性甲羟戊酸拮抗，也进一步支持甲羟戊酸途径可能参与了阿托伐他汀的非调脂作用. 另外，有研究［11］表明，他汀类药物并不改变ET1转录的稳定性，提示阿托伐他汀减少ET1合成和释放的作用可能是通过抑制ppET1 mRNA表达实现的.

    　　我们从细胞、分子和mRNA水平观察到阿托伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制醛固酮诱导的CFs ppET1 mRNA表达、以及ET1的合成和释放. 鉴于ET1与心肌纤维化的发生、发展密切相关，进一步支持他汀类药物可能通过甲羟戊酸途径抑制ET1表达，减轻心肌纤维化.

    【参考文献】  　　［1］冯惠清，崔炜，冯惠平，等. 醛固酮对新生大鼠心肌成纤维细胞分泌ET, NO功能的影响［J］. 中国应用生理学杂志, 2005, 21(1): 78-80.

    　　［2］杨竞霄，赵连友，郑强荪，等. 尾加压素Ⅱ对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及细胞内信号转导机制［J］. 第四军医大学学报, 2004, 25(6): 519-522.

    　　［3］Sun XC, Li WB, Li QJ, et al. Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic tolerance via p38 MAPK［J］. Brain Res, 2006, 1084(1): 165-174.

    　　［4］刘颖，何金，刘志民，等. 胰岛素抵抗大鼠血糖正常阶段心肌内皮素1、内皮型一氧化氮合酶表达的改变［J］. 中华内分泌代谢杂志, 2006, 22(1): 28-29.

    　　［5］Kaneto H, Morrissey J, Klahr S. Increased expression of TGFbeta 1 mRNA in the obstructed kidney of rats with unilateral ureteral ligation［J］. Kidney Int, 1993, 44(2): 313-321.

    　　［6］王海燕，贾国良，郭文怡，等. 比索洛尔对充血性心衰患者CGRP和ET1浓度及心脏功能的影响［J］. 第四军医大学学报, 2003, 24(7): 658-660.

    　　［7］田建伟，赵连友，王士雯，等. 阿伐他汀对幼年大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其意义［J］. 中华医学杂志, 2003, 83(2): 118-122.

    　　［8］李爱国，赵连友，郑强荪，等. 阿伐他汀对自发性高血压大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响［J］. 高血压杂志, 2004, 12(1): 54-57.

    　　［9］Lee TM, Lin MS, Chou TF, et al. Additive effects of combined blockade of AT1 receptor and HMGCoA reductase on left ventricular remodeling in infarcted rats［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 291(3): H1281-H1289.

    　　［10］Mozaffarian D, Minami E, Letterer RA, et al. The effects of atorvastatin (10 mg) on systemic inflammation in heart failure［J］. Am J Cardiol, 2005, 96(12): 1699-1704.

    　　［11］HernandezPerera O, PerezSala D, NavarroAntolin J, et al. Effects of the 3hydroxy3methylglutarylCoA reductase inhibitors, atorvastatin and simvastatin, on the expression of endothelin1 and endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial cells［J］. J Clin Invest, 1998, 101(12): 2711-2719.