糖尿病胃肠组织微血管中细胞外信号调节激酶磷酸化的探讨
发表时间：2012-03-01 浏览次数：615次
作者：黄艳,景丽,张建中,秦憬 作者单位：1.宁夏医学院基础学院病理学教研室，银川;2.宁夏医学院附属医院病理科，银川
【摘要】目的 探讨糖尿病微小血管病变的发生机制。方法 采用免疫组织化学方法，观察糖尿病和非糖尿病病人胃肠微小血管内皮细胞及平滑肌细胞中细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和ets样基因-1(ELK-1)的磷酸化情况。结果 糖尿病组胃肠道组织各层中微小血管内皮细胞磷酸化ERK1/2阳性率明显高于非糖尿病组(P<0.05)。糖尿病组胃肠道组织黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层微小血管内皮细胞中，磷酸化ELK-1阳性率分别为91.0%、91.7%、93.6%和65.3%，与非糖尿病组比较(分别为92.7%、91.3%、91.3%和0)，除了浆膜层以外，其余各层差异无统计学意义(P>0.05)。在糖尿病组，胃肠道组织黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层微小血管中平滑肌细胞磷酸化ERK1/2阳性率与非糖尿病组差异无统计学意义(P>0.05);糖尿病组胃肠道组织各层微小血管平滑肌细胞中磷酸化ELK-1阳性率与非糖尿病组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组内皮细胞中磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1阳性率正相关(r=0.510，P=0.000);血管平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1表达显示正相关(r=0.386，P=0.000)。结论 在糖尿病病人胃肠微小血管中存在ERK1/2信号转导通路的异常激活。
【关键词】 糖尿病,胃,肠;微血管;细胞外调节蛋白激酶;ets样基因-1
Abstract: Objective To explore the mechanism of diabetic microangiopathy. Methods The phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2) and ets like gene-1 (ELK-1)in the gastrointestinal microvascular endothelial cells and smooth muscle cells in diabetic with non-diabetic patients were observed with immunohistochemistry. Results phospho-P44/P42MAPK positive expression in microvascular endothelial cells, the positive rate of Gastrointestinal organizations layers in diabetic group were significantly higher than that in non-diabetic group(P<0.05);Phosphorylation-ELK-1 positive expression in microvascular endothelial cells, the positive rate of gastrointestinal mucosa, submucosa, muscularis and serosal layer microvascular endothelial cells in diabetic group were 91.0%, 91.7%, 93.6% and 65.3%, and in non-diabetic group (respectively 92.7%, 91.3%, 91.3% and 0). in addition to serosal layer, the remainiy layers were no significant differenles(P>0.05). In diabetic group, phospho-P44/P42MAPK positive expression rate of gastrointestinal mucosa, submucosa, muscularis, serosal layer microvascular smooth muscle cells had no significant difference compared with the non-diabetic group (P>0.05);In the diabetic group, Phosphorylation-ELK-1 positive expression rate of gastrointestinal mucosa, submucosa, muscularis, serosal layer microvascular smooth muscle cells had significant difference compared with the non-diabetic group (P<0.05). In microvascular endothelial cells , phospho-P44/P42MAPK and Phosphorylation-ELK-1 expression showed a positive correlation (r =0.510, P= 0.000);In microvascular smooth muscle cells, phospho-P44/P42MAPK and Phosphorylation-Elk-1 expression showed a positive correlation (r=0.386,P=0.000). Conclusion Abnormal activation by phosphorelation of ERK1/2 signal transduction pathway was probably involved in the changes of gastrointestinal microvessels in diabetic patients.
Key words: diabetes mellitus;gastrointestine;Microvessel;extracellular signal -regulated kinase1/2;ets-like gene-1
糖尿病微血管病变是多种器官损害的病理生理基础，是糖尿病致死致残的主要原因之一。在糖尿病时，可能有多种因素参与微血管病变的形成[1]。近来的研究提示，某些细胞外信号转导通路的异常变化可能介导了糖尿病微血管病变，丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，尤其是细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)可能参于了糖尿病血管并发症的发生发展[2]。本研究采用免疫组织化学技术，对比研究了糖尿病人胃肠组织微血管中磷酸化ERK1/2及其下游作用底物磷酸化ets样基因-1(ets-like gene 1，ELK-1)的表达情况。
1 材料和方法
1.1 标本来源
收集宁夏医学院附属医院2001年4月—2006年12月因为其他疾病进行手术的糖尿病病人胃肠组织标本蜡块38例(简称糖尿病组)，患者年龄38～82岁，平均56岁，男24例，女14例，平均血糖8.7mmol/L;同时收集其他疾病进行手术的非糖尿病病人胃肠蜡块标本20例(简称非糖尿病组)，患者年龄38～83岁，平均59岁，男13例，女7例，平均血糖在正常范围内。
1.2 主要试剂
兔抗人phospho--P44/P42(Cell Signaling公司)单克隆抗体，小鼠抗人Phospho-ELK-1(Cell Signaling公司)单克隆抗体; 链霉素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin-peroxidase，S-P)免疫组化检测试剂盒(Zymed公司产品);浓缩型DAB试剂盒;多聚赖氨酸防脱片剂，以上试剂购自陕西重信生物技术有限公司
1.3 组织病理学观察
将石蜡包埋的胃肠组织制成5μm切片，HE染色，观察胃肠组织微小血管的基本情况，胃肠间质炎性细胞浸润等病变。
1.4 免疫组织化学染色
将石蜡包埋的胃肠组织制成厚5μm切片，常规脱蜡至水，3%双氧水室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶;微波抗原修复;正常山羊血清封闭，室温下放置15min，倾去血清;兔抗人phospho-P44/P42MAPK单克隆抗体、小鼠抗人Phospho-ELK-1单克隆抗体工作浓度为1∶100稀释，在湿盒内4℃过夜;生物素标记第二抗体工作液及辣根酶标记的链霉素卵白素工作液; DAB室温下显色，苏木素轻度复染;脱水、透明、封片。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.5 统计学方法
用SPSS 12.5统计软件进行数据统计处理，采用卡方检验及秩相关方法分析，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 组织病理学观察
所有病例的标本胃肠结构完整，包括了黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层，无肿瘤组织和其他明显病变。糖尿病组与非糖尿病组的胃肠间质有少量淋巴细胞、单核细胞等炎细胞浸润，特别是黏膜层炎细胞浸润比较明显。在各层中血管分布均匀，大多数病例血管结构无明显异常改变，少数糖尿病组的病例部分血管壁增厚，内皮细胞肥大肿胀。非糖尿病组中的血管壁和内皮细胞无明显改变。
2.2 免疫组化结果
磷酸化ERK1/2、ELK-1阳性为细胞核与细胞浆上棕黄色染色;每张切片分别于黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层随机采取20个高倍镜(×40)视野观察微血管(直径在 100μm以下血管)内皮细胞及平滑肌细胞磷酸化表达，并计数内皮细胞及阳性内皮细胞数、血管平滑肌细胞及阳性血管平滑肌细胞数。
磷酸化ERK1/2主要表达于内皮细胞的细胞核与细胞浆内(图1，见封2)。糖尿病组胃肠道组织各层中微小血管内皮细胞磷酸化ERK1/2阳性率高于非糖尿病组(P<0.05)，详见表1;在糖尿病组，胃肠道组织黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层微小血管中平滑肌细胞磷酸化ERK1/2阳性率与非糖尿病组比较无统计学意义(P>0.05)，详见表2。表1 胃肠道组织血管内皮细胞中磷酸化ERK1/2表达结果(略)表2 胃肠道组织血管平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2表达结果(略)
糖尿病组胃肠道组织黏膜层、黏膜下层、肌层血管内皮细胞中，磷酸化ELK-1阳性率与非糖尿病组比，除了浆膜层以外(图2，见封2)，其余各层无统计学意义(P>0.05)，详见表3;糖尿病组胃肠道组织黏膜层和浆膜层血管平滑肌细胞中磷酸化ELK-1阳性率与非糖尿病组比较，有统计学意义(P<0.05)，详见表4。表3 胃肠道组织血管内皮细胞中磷酸化ELK-1表达结果(略)表4 胃肠道组织血管平滑肌细胞中磷酸化ELK-1表达结果(略)
2.3 磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1表达的相关性
分别对糖尿病组和非糖尿病组胃肠微小血管内皮细胞和平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1表达进行秩相关分析，内皮细胞中磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1阳性率正相关(r=0.510，P=0.000)，血管平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2与磷酸化ELK-1表达显示正相关(r=0.386，P=0.000)。
3 讨论
微血管病变是糖尿病特有的慢性血管并发症，主要表现为视网膜、肾脏等微血管病变。糖尿病微血管病的表现多样，早期最突出的病变为微血管内皮细胞功能障碍[3]。由于对某些刺激比大血管内皮细胞更敏感[4]，因此病变出现较早，较广泛，是糖尿病各种并发症的发生基础。糖尿病微血管病变的发生及发展是多因素综合作用的结果，已有研究显示，糖尿病状态下的高糖-蛋白激酶c(PKc)通路[5]、糖基化终产物、氧化应激[6]、生长因子[7]、渗透压、牵张刺激[8]，还有血管紧张素Ⅱ等都可激活MAPK家族[9]，使转录因子活性升高，参与糖尿病微血管病变的发生。本研究显示糖尿病组胃肠道组织各层中血管内皮细胞磷酸化ERK1/2与其下游作用底物ELK-1表达均明显增高，提示在糖尿病病人胃肠微小血管中存在ERK1/2信号转导通路的异常激活。
MAPK是信号转导途径之一，细胞外刺激可经G蛋白受体、生长因子受体和酪氨酸蛋白激酶受体，经Raf-MEK-ERK级联信号激活ERK，调节转录因子(如ELK-1、ATF2、C-Myc、STAT等)和一些激酶活性，促进细胞增殖，蛋白质合成[2]。高糖经蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、二酞基甘油-PKC通路及氧化应激等途径导致ERK1/ERK2的激活，进而磷酸化转录因子，调节基因表达，ERK1/ERK2成为高糖所致不同信号通路的交汇点，因此，ERK1/ERK2被视为高糖致糖尿病并发症的信号传导子[10]。有研究证明，在高血糖状态下，葡萄糖激活PKC，PKC经Raf/MEK/ERK级联信号激活ERK，进而c-Jun和c-Fos蛋白苏氨酸/酪氨酸残基磷酸化修饰而激活转录因子引起肾小球系膜中各种ECM的产生增多[11]。白蛋白-非酶糖基化终末产物(A1b-AGE)经ERK独立通路，激活HIF-1，刺激VEGF的表达可能在糖尿病视网膜病变的发展过程中起重要作用[12-13]。Suzuki等[14]发现高糖、AngⅡ使VSMC纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)mRNA的表达上调，血浆中PAI-1浓度增高，可通过激活MAPK和PKC通路介导Raf-ERK通路上调而增强FLICE抑制蛋白(FLIP)的活性和促进血管平滑肌细胞的增生[15]。本研究通过组织病理学方法虽然未发现胃肠微血管的明显病变，但是通过免疫组化证明在糖尿病组胃肠道组织各层中血管内皮细胞磷酸化ERK1/2表达明显高于非糖尿病组，磷酸化ELK-1表达也明显高于非糖尿病组，提示在糖尿病胃肠组织中可能已存在微小血管功能障碍。
本实验证明ERK1/2通路在糖尿病人体胃肠组织微血管中磷酸化表达增强，与在糖尿病动物模型组织微血管中磷酸化的表达趋势一致。由于糖尿病微血管病变的形成受多种因素的影响，同时ERK1/2信号转导系统具有非常复杂的作用机制，MAPK在糖尿病微血管病变发生中的具体通路和机制还有待进一步探讨。
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