阿托伐他汀对高胆固醇兔脑组织血管紧张素Ⅱ和血红素氧合酶1表达的影响

作者：曹春蕾1, 鹿育萨2    作者单位：山西医科大学，山西 太原 030001

【摘要】  目的 建立兔高胆固醇动脉粥样硬化模型，观察阿托伐他汀对脑组织血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和血红素氧合酶1（HO1）表达的影响。方法 24只健康新西兰白兔随机分为3组：正常对照组,高脂饮食组,高脂饮食加阿托伐他汀组。喂饲8周后，取血测定血清总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平，取脑组织检测AngⅡ和HO1的表达。结果 （1）AngⅡ的表达：高脂组明显高于对照组，他汀组表达较高脂组明显降低（P＜0.05）；（2）HO1的表达：高脂组较对照组明显升高，他汀组较高脂组进一步升高（P＜0.05）。结论 高胆固醇血症时脑组织肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）处于激活状态，阿托伐他汀通过抑制AngⅡ的生成并相应增加HO1的表达，对机体起到抗动脉粥样硬化的保护作用。

【关键词】  高胆固醇； 阿托伐他汀； 血管紧张素Ⅱ； 血红素氧合酶

    Effect of atorvastatin on angiotensinⅡ and hemo oxygenase1 expression in the brains of hypercholesterolemic rabbit    CAO Chunlei1，LU Yusa2. 1.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Cardiology, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

    Abstract：Objective  To establish model of rabbit with hypercholesterolemia and investigate the influence of Atorvastatin on the expression of angiotensinⅡ(AngⅡ) and hemo oxygenase1 (HO1) in rabbit brain tissue.   Methods  Twentyfour healthy NewZealand albino rabbits were divided into 3 groups randomly: normal control, high cholesterol diet, high cholesterol diet and Atorvastatin. After feeding for 8 weeks, fasting blood samples were collected and total cholesterol（TC）and low density lipoprotein cholesterol (LDLC) levels were determined. Rabbit brains were extracted after sacrifice and expressions of AngⅡand HO1 were assayed.   Results  AngⅡ expression in high cholesterol diet group was higher than in control group (P＜0.05); AngⅡ expression in Atorvastatin group was lower than in high cholesterol diet group (P＜0.05). HO1 expression in high cholesterol diet group was higher than in control group (P＜0.05); HO1 expression in Atorvastatin group was higher than in high cholesterol diet group (P＜0.05).    Conclusions  Renninangiotensin aldosterone system (RAAS) in brain tissue is activated under high cholesterol diet. Atorvastatin can prevent atherosclerosis by reducing AngⅡ production and increasing HO1 expression.

    Key words：  Hypercholesterolemia；  Atorvastatin；  AngiotensinⅡ；  Hemo oxygenase1

    动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是严重危害人类健康的常见病。目前认为高胆固醇血症是AS最早的病变环节之一,是心脑血管疾病常见的独立危险因素[1]。脑AS已成为脑血管疾病的第一位原因，但有关高胆固醇本身对脑组织的影响及其所致的脑AS研究较少，以往研究多集中于冠状动脉、机体各大动脉。近年来发现的血红素氧合酶系统在脑血管疾病中的表达及作用受到国内外学者的关注，在AS发生发展的复杂的病理生理过程中局部肾素血管紧张素醛固酮系统（renninangotensinaldosterone system, RAAS)同样扮演着重要角色。为此，我们采用兔高胆固醇动脉粥样硬化模型，探讨血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ)和血红素氧合酶1(hemo oxygenase1，HO1）在脑AS发生中的联系及阿托伐他汀的干预效果。1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物及分组  24只健康2月龄雄性新西兰白兔（山西省农业科学院提供），体重（2.0±0.2）kg，适应性喂养1周后，随机分为3组，每组8只：正常对照组（普通饲料），高脂饮食组（1%胆固醇+4%猪油+95%普通饲料），高脂饮食加阿托伐他汀组（2.5 mg·kg－1·day－1），各组饲养8周。

    1.1.2  仪器和试剂   LX20全自动生化分析仪（Backmaan公司），多功能冷冻水平离心机（德国Heraeus Biofuge Stratos），DYY2C型电泳仪（北京六一仪器厂），Mias2000图像分析系统（四川川大智胜软件股份有限公司），阿托伐他汀（大连辉瑞制药有限公司），AngⅡ、HO1多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  血脂检测  于8周末在清醒状态下经兔中央动脉取空腹血标本（禁食12 h），在BackmaanLX20全自动生化分析仪上成批测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterel,LDLC)的水平。

    1.2.2  标本制备  第八周末，20%的乌拉坦 5 ml/kg 处死动物，取脑及颈动脉，生理盐水冲洗后，对颈动脉进行肉眼形态学观察；将脑组织置于10%的中性福尔马林溶液中浸泡固定48 h，常规酒精脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，分别做HE染色及免疫组化染色；余新鲜脑组织置于－70℃冰箱保存备用。

    1.2.3  AngⅡ和HO1的免疫组化染色  按照SABC试剂盒说明书进行，并以PBS代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察到细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性细胞。在400倍高倍镜下随机取35个不重叠视野，采用Mias2000 图像分析系统，计算阳性单位值（positive unit，PU）。

    1.2.4  Westernblot检测HO1的蛋白表达  剪取新鲜组织100 mg，加入1 ml RIPA和10 μl PMSF, 冰浴中超声破碎组织细胞，4℃，2000 r/min离心20 min，取上清。Lowry法测总蛋白水平。灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶( 10%分离胶, 5%浓缩胶)，以每孔50 μg的蛋白量上样，转膜，封闭，加入HO1兔多克隆抗体( 1∶2.00稀释) 4℃孵育过夜，加二抗，显色。计算机扫描并计算平均吸光度值。

    1.3  统计学处理

    计量资料以均数±标准差（±s）表示,采用SPSS11.5统计软件,组间差异先用单因素方差分析，再用SNKq检验；两组比较用两样本t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。2  结果

    2.1  血脂测定

    8周后血脂测定，高脂组的TC及LDLC水平较对照组明显升高（P＜0.05）；他汀组的TC及LDLC水平较高脂组明显下降（P＜0.05），但较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。 表1  兔血清TC、LDLC含量的变化注：与正常组比较，aP＜0.05；与高脂组比较，bP＜0.05

    2.2  颈动脉病理学改变

    肉眼可见正常对照组内膜光滑，无斑块形成。高脂饮食组血管表面粗糙，凹凸不平，大量黄白色斑块突出于管腔表面，并连接成片，阿托伐他汀组粥样斑块明显减少，证明造模成功。

    2.3  免疫组化检测脑组织AngⅡ和HO1的表达

    正常组只表达少量的AngⅡ和HO1，高脂组AngⅡ和HO1阳性染色明显增强；他汀组与高脂组比较AngⅡ阳性单位明显降低(P＜0.05)，但仍高于正常组(P＜0.05)；他汀组与高脂组比较HO1阳性单位明显升高(P＜0.05)（图1，表2）。

    2.4  Western blot测定脑组织HO1的表达

    3组动物脑组织HO1/βActin平均吸光度值分别为：0.4182±0.0019,0.6821±0.0019,0.9188±0.0015。对照组HO1蛋白带显影不明显, 高脂组较对照组比差异有统计学意义，阿托伐他汀组较其余两组比较差异均有统计学意义（图2）。  表2  三组动物脑组织AngⅡ、 HO1 阳性单位水平比较注：M：预染色蛋白质Marker；1：正常组；2：高脂组；3：他汀组

    3  讨论

    AS及其所致的心脑血管疾病不仅在发达国家，在我国也成为危害严重的疾病[2 ,3]。目前脑血管疾病发病率高，已成为人类3大死亡原因之一。多数学者认为，高胆固醇血症及AS时脑组织处于缺血缺氧状态，且发生了病理形态学改变，脑局部RAAS被激活，其主要活性成分AngⅡ通过不同的机制导致AS的发生。而AS是一个多因性疾病,AS病变的形成可能是机体内致AS因素与抗AS防御系统之间的平衡障碍[4] , HO系统是体内抗AS 重要防御体系之一,多种细胞培养和动物实验均表明，HO1可通过多种途径发挥抗AS作用。

    迄今为止，发现HO在体内有HO1、HO2、HO3 3种同工酶。HO1为诱导型,亦称热休克蛋白32 (HSP32), 血色素、金属元素、应激状态、感染、oxLDL和缺氧状态等因素的作用均能诱导HO1 的表达； HO2 和HO3 是结构型酶。HO的主要功能是代谢血红素形成胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁,胆绿素则被胆绿素还原酶进一步还原生成胆红素 [5]。CO长期以来被认为是体内代谢废物，随着内生性NO 生物学功能的揭示及NO 与CO 相互关系的发现,CO 的信使作用已引起医学界的真正重视[6]。CO 作为气体信使分子, 通过激活cGMP引起一系列的病理生理改变而起到脑组织保护作用。胆绿素和胆红素是体内重要的抗氧化物质。体外实验证明，等摩尔浓度下，胆红素的抗氧化活性强于VitC及Trolox（VitE类似物），在正常血清水平时，胆红素是一种很强的内源性抗氧化剂，能清除过氧基团，抑制脂质过氧化反应[7]。除自身的抗氧化活性外，胆红素还能增强VitC与VitE的抗氧化能力。同时,游离铁能与铁蛋白结合,减少自由态铁的含量,从而中和铁的氧化毒性,铁蛋白同样具有抗氧化作用[8]。由此推测，HO很大程度依赖其下游产物发挥作用。

    本实验分别采用免疫组化与Western blot的方法观察了HO1表达情况，发现高脂组HO1表达明显高于对照组，阿托伐他汀能使其表达进一步升高，提示HO1表达增加可能是机体对疾病损害的一种自身保护反应。研究结果显示，高胆固醇兔脑组织HO系统活化与RAAS的激活有关，即AngⅡ表达的上调可诱导HO1的表达。近年研究发现他汀类药物尚有许多非降脂作用，包括抗炎、增加内皮细胞NO生成、增加组织型纤溶酶原激活剂表达和减少氧自由基生成等[9]。阿托伐他汀不仅可以明显降低高胆固醇兔的血清TC和LDLC，而且能够抑制脑组织RAAS，降低AngⅡ表达，并上调HO1的表达，对机体抗AS等有保护作用。因而，积极使用他汀类药物在防治AS中显得更为重要。目前我们对于阿托伐他汀与HO系统关系的研究仅限于动物实验,其具体机制尚不明了，相信随着研究的深入,HO1可能成为临床防治AS的新靶点。

【参考文献】  ［1］Kelm M. The Largininenitric oxide pathway in hypertension[J]. Curr Hypertens Rep, 2003, 5:8086.

［2］Kiechl S，Willeit J.The natural course of atherosclerosis part 1：incidence and progression[J]. ATVB，1999 19：14841490.

［3］中华心血管病杂志编辑委员会.中华医学会第五次全国心血管学术会议纪要[J].中华心血管病杂志,1999,27:166172.

［4］Rabelink TJ, Stroes E. Atherosclerosis: defeat of defense [J]? Circ Res，2001，88:456457.

［5］Hoekstra KA, Godin DV, Cheng KM. Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis [J]. Biochem Cell Biol, 2004, 82:351359.

［6］Veima A, Hirsch DJ, Glatt CE, et al. Carbon monoxide :a putative neural messenger[J]. Science, 1993, 259:309.

［7］Llesuy SF,Tomaro ML.Home oxygenase and oxidative stress:Evidence of involvement of bilirubin as physiological protector against oxidative damage[J]. Biochim Biophys Acta，1994,1223:914.

［8］Baranano DE,Wolosker H, Bae B I, et al. A mammalian iron ATPase induced by iron [J]. J Biol Chem, 2000, 275:1516615173.

［9］Wierzbicki AS，Poston R，Ferro A. The lipid and nonlipid effect of statins [J]. Pharmacol Ther 2003，99:95112.