慢性房颤对风湿性心脏病心房肌细胞ELK-1、p-ELK-1表达

　　作者：曾祥君,肖颖彬,陈林,钟前进,王学锋　　作者单位：第三军医大学新桥医院全军心血管外科中心,重庆400037

　　提　要:目的　研究风湿性心脏病慢性房颤患者心房肌细胞ELK-1、p-ELK-1的表达,探讨房颤发生与ELK-1、p-ELK-1表达之间的关系。方法　12例风心病换瓣患者分为2组:①慢性房颤组(6例)房颤持续时间均>6个月,②窦性心律组(6例)为正常心律。手术中切取少许右心房游离壁组织采用免疫组化和间接免疫荧光技术检测心房肌ELK-1、p-ELK-1的表达与分布。结果　①免疫组化显示ELK-1主要表达在心房肌细胞质和细胞核,慢性房颤心房肌较窦性心律心房肌表达明显减弱;②间接免疫荧光技术显示ELK-1在窦性心律心房肌细胞核表达相对较高,在房颤心房肌细胞核中表

　　达明显受到抑制; p-ELK-1在房颤心房肌、窦性心律心房肌均表达受抑。结论　转录激活因子ELK-1的表达改变可能在慢性房颤心房肌的分子重构中起着重要的作用。

　　关键词:房颤,逆向分化,转录激活因子,ELK-1

　　Abstract:Objective　To investigate the influence of chronic atrial fibrillation(CAF)on ELK-1 and pELK-1 in the atrialmyocytes from the rheumatic heartdisease patients.Methods　Rightatrialmyocardium wasobtained from 12 patientsundergoing valve replacement,6 patientswithCAFmore than 6months and 6 patientswith sinus rhythm(SR). The expressions of the ELK-1 and p-ELK-1 were examined by immunohistochemicalstaining and indirect immunofluorescence.Results　Immunohistochemistry showed that the protein expressionofELK-1 was significantly reduced in atrial tissue ofCAF patients as compared to that in SR patients,and immunostainingwasmainly in both cytoplasm and nuclei of atrialmyocardium. Indirect immunofluorescence againstELK-1 showed that the nuclei ofSR cellswere densely labeled,whereas nuclei in CAF cellswere veryfaintly labeled. Indirect immunofluorescence against p-ELK-1 showed the nuclei in CAF cells and SRl cellswere allvery faintly labeled.Conclusion　Our results suggestthatthe expression change of transcriptionalactivatorELK-1 mightplay an important role in the pathogenesis of atrial fibrillation.

　　Key words:atrial fibrillation;dedifferentiation;transcriptional activator;ELK-1

　　心房颤动(简称房颤)是常见的心律失常,其发病机制尚不十分清楚。目前证实心房肌电生理重构和结构重构是房颤发生发展的基础[1]。Thijssen等[2]发现房颤心房肌出现胚胎期表现,认为心房肌在房颤状态下的重构是适应性的反分化。转录激活因子ETS样蛋白1(ETS-like1, ELK-1),作为ETS家族(命名缘于禽类白血病病毒基因E26)成员之一,在细胞分化调节参与调控房颤心房肌的分子和结构重构。本实验采用免疫组化和间接免疫荧光技术,观察了转录激活因子ELK-1及其磷酸化形式p-ELK-1在慢性房颤心房肌的表达改变,以探讨房颤发生与ELK-1、p-ELK-1之间的关系。

　　1　材料与方法

　　1. 1　研究对象

　　研究对象为2005年3-5月在本中心住院、接受心脏瓣膜置换手术的风心病患者共12例,其中慢性房颤心律者(房颤持续时间>6个月)6例,窦性心律者6例,平均年龄(47. 2±6. 5)岁。合并高血压、高血脂、糖尿病、冠心病及感染性心内膜炎的风心病患者不纳入本研究。

　　1. 2　心房肌标本留取

　　行心脏瓣膜置换术建立体外循环时切取少许右心房游离壁组织,立即置于液氮中保存备用。

　　1. 3　免疫组化染色及图像处理

　　1. 3. 1　免疫组化染色

　　具体步骤为:①连续冰冻切片厚3μm,冰丙酮固定20 min;②3%过氧化氢10 min;③山羊血清封闭20 min,兔抗人ELK-1多克隆抗体(1∶300,Cellsignal公司,美国), 4℃过夜;④二抗常温2 h;⑤SP复合物常温2 h;⑥DAB显色;⑦苏木精轻度复染, 1%盐酸酒精分化;⑧中性树脂封片。以上每步均用PBS充分漂洗。设立用PBS代替一抗而其他条件均相同的阴性对照。免疫组化切片光镜下分析,以背景适度,点状或条状棕褐色显色为阳性表达。

　　1. 3. 2　图像分析处理

　　将免疫组化切片置Olympus显微镜下(物镜×40),对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入HPIAS-2000多媒体彩色病理图像分析系统进行处理,每例随机选取5个完整而不重叠的视野进行定量分析,测定免疫组化反应阳性颗粒的平均吸光度和面积百分数,取每张切片的(-x±s)作为该例的测量值。

　　1. 4　免疫荧光方法染色

　　①~③步同免疫组化染色;④加入荧光素标记的羊抗兔IgG-TRITC(1∶200, Sigma公司,美国),常温2 h;⑤苏木精轻度复染, 1%盐酸酒精分化;⑥PBS充分漂洗,甘油封片。设立用PBS代替一抗而其它条件均相同的阴性对照。

　　1. 5　统计学处理

　　实验数据以-x±s表示,用SPSS 10. 0统计软件进行t检验。

　　2　结果

　　2. 1　免疫组化法观察心房肌转录激活因子ELK-1的表达和分布

　　转录激活因子ELK-1蛋白阳性表达为棕褐色细颗粒。房颤心房肌细胞细胞质着色较淡,细胞核呈蓝色,清晰;窦性心律心房肌细胞细胞质着色较深,细胞核呈蓝色,上面覆盖一层棕褐色细颗粒。因此,ELK-1蛋白分布在心房肌组织细胞质和细胞核。免疫组化反应阳性颗粒的平均吸光度慢性房颤组较窦性心律组低[分别为(0•953±0•182)、(8•215±0•422),P<0•01),阳性面积率慢性房颤组较窦性心律组低[(0•142±0•054)、(0•452±0•087),P<0•05)],表明慢性房颤心房肌ELK-1表达较窦性心律心房肌明显减弱(图1)。

　　2. 2　间接免疫荧光法观察心房肌转录激活因子ELK-1、p-ELK-1在心房肌细胞核的表达

　　苏木精复染后普通光镜下观察心房肌形态轮廓及细胞核位置,与同视野的免疫荧光图像比较,观察ELK-1在细胞核的表达。每个切片选取5个完整而不重叠的视野进行记数,结果显示心房肌细胞核ELK-1阳性率窦性心律组较慢性房颤组高[分别为(92. 3±8. 4)%、(5. 3±0. 8)%,P<0•01)],表明ELK-1在窦性心律心房肌细胞核的表达明显(图2);心房肌细胞核p-ELK-1阳性率窦性心律组与慢性房颤组均低[分别为(3. 2±0. 6)%、(4. 1±0. 8)%,P>0•05],表明p-ELK-1在窦性心律心房肌及慢性房颤心房细胞核的表达均较弱(图3)。A:PBS代替一抗的阴性对照;B:房颤心房肌;C:窦性心律心房肌　心房组织ELK-1阳性表达为棕褐色细颗粒图1　转录激活因子ELK-1蛋白表达的免疫组织化学染色结果　(S-P×400)A、B:PBS代替一抗的阴性对照;C、D:房颤心房肌;E、F:窦性心律心房肌。房颤心房肌细胞核ELK-1低表达;窦性心律心房肌细胞核ELK-1表达明显图2　转录激活因子ELK-1蛋白表达的免疫荧光染色结果　(×400)

　　A、B:PBS代替一抗的阴性对照;C、D:房颤心房肌;E、F:窦性心律心房

　　肌房颤心房肌、窦性心律心房肌细胞核p-ELK-1表达均不明显

　　3　讨论

　　本实验采用免疫组织化学和间接免疫荧光技术证明:转录激活因子ELK-1分布于心房肌细胞质和细胞核;慢性房颤心房肌中ELK-1表达明显降低;ELK-1在窦性心律心房肌细胞核中表达较明显,在慢性房颤心房肌细胞核中表达明显受抑; p-ELK-1在慢性房颤心房肌细胞核与窦性心律心房肌细胞核中表达均较弱。

　　转录激活因子ELK-1在各种组织细胞中广泛存在,是ERK、JNK和P38等3种丝裂原活化蛋白激酶共同的靶蛋白,磷酸化的ELK-1与DNA结合力增强并激活转录。转录激活因子ELK-1同样具有转录抑制作用,譬如ELK-1可单独与DNA上ETS位点结合抑制转录激活。转录激活因子ELK-1表达降低,势必引起一系列基因的协同改变[3]。

　　目前发现房颤心房肌的重构本质上是细胞反分化改变,结构重构和电生理重构是房颤心房肌反分化改变的不同表现[4]。L型钙通道编码基因CACNA1C、α/β肌凝蛋白重链分子、心房利钠因子、α平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscle actin,α-SMA)、钠钙交换器、肌浆网钙离子ATP酶及结蛋白等基因的表达改变,是慢性房颤心房肌细胞分子重构的一部分。在这些基因的调控序列中,存在一个共同的调节元件,即在它们的启动子中都存在一个称为CArG盒的转录因子血清反应因子(serum reaction factor, SRF)结合位点[5]。转录激活因子ELK-1恰好只有通过与SRF相互作用,形成三重复合结构,才能上调基因转录活性。慢性房颤心房肌ELK-1表达降低,提示ELK-1可能参与调节房颤心房肌重构相关的基因表达。

　　目前一些实验数据提示了ELK-1与房颤重构相关基因表达的相关性。平滑肌细胞中ELK-1的过度表达下调了α-SMA的基因转录[5, 6]。ELK-1基因敲除证明ELK-1在调节平滑肌肌细胞特异性基因表达中起着重要作用,并导致平滑肌细胞出现一定程度的反分化改变[7]。钙调磷酸酶可激活转录因子NFAT3,在慢性房颤患者心房肌中钙调磷酸酶的活性和蛋白水平明显上调。因为钙调磷酸酶是针对转录激活因子ELK-1的主要磷酯酶,将磷酸化的ELK-1转化为非磷

　　酸化的ELK-1,所以表达下调的ELK-1和表达上调的钙调磷酸酶可以协同调节房颤心房肌的分子重构基因的表达[8]。血管平滑肌细胞中L型钙通道在分化状态表达水平较高,而在反分化状态表达水平较低[9]。

　　综上所述,我们的结果提示转录激活因子ELK-1表达下调可能在慢性房颤心房肌的分子重构中起着重要的作用。在本研究中,尽管我们观察到慢性房颤患者心房肌中转录激活因子ELK-1表达下调,但是表达下调的ELK-1与房颤心房肌的分子重构间仍缺乏直接的证据。在今后的研究中,我们需要探讨慢性房颤如何导致转录激活因子ELK-1的表达下调,以及表达下调的ELK-1调控房颤心房肌分子重构的直接证据。

　　参考文献:

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