C/EBPα-Per2信号通路对K562细胞相关基因的调控机制

　　CCAAT增强子结合蛋白α(CCAATenhancerbindingproteinα，C/EBPα)是一种转录因子，在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)的发生和分化增殖中具有重要调控作用[1-3]。作者前期研究表明转染外源性C/EBPα能够增加节律基因———Per2基因的表达，并降低cyclinB1、c-myc的表达水平，从而抑制白血病细胞恶性增殖，促进细胞分化，进而逆转K562细胞的恶性表型[4-5]。为进一步探讨是否存在C/EBPα经由Per2基因进行相关基因调控的信号通路。本课题在成功转染C/EBPα的K562细胞中转入Per2基因RNA干扰质粒，通过干扰K562细胞中Per2基因的表达，观察C/EBPα下游靶基因的表达水平，进而分析Per2基因在C/EBPα 参与调控的CML发生发展中的重要作用。

1　材料与方法

1.1　材料　胎牛血清购于美国Gibco公司，质粒提取试剂盒购于Omega公司，总RNA提取试剂、反转录酶(MMLV)及限制性内切酶购自TaKaRa公司，脂质体(Lipofectamine2000)购自美国Invitrogen公司，鼠抗人c-myc、cyclinB1、p53、Per2单抗购自美国SantaCruzBiotechnology公司，羊抗鼠二抗购自武汉博士德公司。

1.2　质粒和细胞系　空载体(pGenesil-3-HK)、Per2干扰质粒(pGenesil-3-SiPer2)由武汉晶赛公司构建，pEGFP-C/EBPα-K562细胞由本室构建保存，按常规方法培养。

1.3　方法

1.3.1　筛选稳定干扰Per2的细胞株　pGenesil-3-HK、pGen-esil-3-SiPer2质粒分别经SalⅠ酶切鉴定，同时作DNA序列分析。采用Lipofectamine2000将pGenesil-3-HK、pGenesil-3-Si-Per2分别转染pEGFP-C/EBPα-K562细胞，设立pGenesil-3-SiPer2转染组(转染组)、pGenesil-3-HK转染组(空载组)、pEGFP-C/EBPα-K562未处理组(对照组)，每组设5个复孔。转染48h，荧光显微镜下观察细胞转染效果，并以新霉素筛选阳性克隆，采用有限稀释法筛选获得稳定转染的单克隆细胞，确定靶细胞中Per2的表达明显降低之后扩大培养用于后续实验。RT-PCR检测Per2mRNA水平：提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR检测。Per2及β-actin引物序列见表1，扩增片段分别为444bp和247bp。PCR扩增条件为94℃ 3min;94℃40s，55℃1min，72℃1min，30个循环;72℃5min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。实验重复3次以确保结果准确性。Westernblot检测Per2蛋白水平：取20μL细胞裂解液用10%的分离胶分离蛋白质，湿转转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，先后与鼠抗人Per2单克隆抗体(1∶100稀释)和羊抗鼠抗体(1∶2000稀释)孵育2h，洗涤后用化学发光进行显色。实验重复3次以确保结果准确性。

1.3.2　RT-PCR检测p53、cyclinB1和c-myc基因的表达　同时提取转染组、空载组、对照组细胞总RNA，逆转录合成cD-NA，进行PCR检测，实验重复3次以确保结果准确性。PCR反应条件：94℃3min;94℃40s，55℃1min，72℃1min，30个循环;72℃5min。取PCR产物5μL上样于1.6%的琼脂糖凝胶中，80V电压，电泳1h。用Bio-Rad凝胶成像系统自带QuantityOne软件分析结果。以目的条带和内参条带的密度之比表示。

1.3.3　Westernblot检测p53、cyclinB1和c-myc蛋白表达　同时收集转染组、空载组、对照组细胞提取细胞总蛋白，并测定蛋白含量。取80μg蛋白进行电泳、电转膜、封闭后，加一抗鼠抗人单克隆抗体孵育过夜，抗体稀释度为1∶100，漂洗后加二抗羊抗鼠(1∶2000)抗体，室温下孵育2h，TBST洗3次后化学发光显示试剂盒显色并成像分析，β-actin作为内参。实验重复3次以确保结果准确性。

1.3.4　统计学处理　采用SAS8.2软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　RNA干扰质粒的鉴定　质粒pGenesil-3-SiPer2和pGenesil-3-HK经SalⅠ单酶切分别得到400bp左右的目的片段和4800bp的骨架片段，见图1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。质粒测序结果正确，见图2～3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.2　稳定干扰Per2的pEGFP-C/EBPα-K562细胞株的构建　转染后48h，倒置荧光显微镜下观察到转染组有明显的荧光信号，见图4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。利用新霉素筛选阳性克隆7d，采用有限稀释法获得稳定转染的单克隆细胞，扩大培养。RT-PCR检测结果发现，转染组细胞相对于对照组和空载组，Per2mRNA水平表达分别下降(75.09±3.98)%和(78.34±5.07)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。Westernblot检测结果显示相对于对照组，转染组细胞Per2蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，说明Per2干扰成功，见图6(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.3　RT-PCR检测p53、cyclinB1和c-myc基因的表达　RT-PCR检测结果发现，以各目的条带和内参β-actin的光密度相比，相对于对照组K562和空载组pGenesil-3-HK-K562细胞，转染组pGenesil-3-SiPer2-K562的p53基因的mRNA表达水平明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01);而cyclinB1和c-myc基因的mRNA表达水平则明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图7(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.4　Westernblot检测p53、cyclinB1和c-myc蛋白的表达　为了进一步分析在Per2干扰后，C/EBPα对相关基因的蛋白水平的调控作用。作者做了Westernblot的检测，以各目的条带和内参β-actin的光密度相比，相对于对照组和空载组，转染组p53蛋白的表达水平明显降低，cyclinB1和c-myc蛋白的表达水平则显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见图8(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

3　讨　　论CML是由bcr/abl融合基因及其编码的融合蛋白引起的造血干细胞恶性增殖性血液系统肿瘤[6]。随着耐药现象的发生，寻找新的治疗靶点已成为白血病治疗工作中的新方向。已知，C/EBPα与Per2基因在白血病中发挥重要调控作用[7-9]。临床资料显示，CML急变期患者的骨髓细胞中野生型C/EBPα的mRNA表达水平降低，且无C/EBPα蛋白的表达[10]。研究发现，C/EBPα主要在转录水平调控粒系和单核系的分化，C/EBPα的突变可以阻滞CML来源的K562细胞的粒系分化[11]。以上资料均提示，C/EBPα可能作为一种抑癌基因参与调控CML的发生发展，然而C/EBPα调控CML的具体机制尚不明确。为此，作者在前期研究发现C/EBPα明显上调Per2表达水平的基础上[4]，进一步探讨Per2在C/EBPα参与调控CML过程中的作用。实验中，作者在成功转染C/EBPα的K562细胞中转入Per2基因的RNA干扰质粒，通过干扰细胞中Per2的表达，分析Per2在C/EBPα的下游所扮演的重要角色。由于转入K562细胞中的C/EBPα是带绿色荧光标记，为了鉴别，作者特意合成了带有红色荧光标记的siRNAPer2进行实验。在本研究中采用的pGenesi-3质粒含有红色荧光蛋白表达基因及新霉素选择性抗性标记基因，适用于阳性克隆细胞株的筛选。通过干扰Per2的表达，作者发现细胞周期中的重要调控基因c-myc和cyclinB1明显恢复表达，而p53的表达出现下调，说明Per2在C/EBPα的下游对基因的调控具有重要的作用，存在C/EBPα调控Per2基因进而影响细胞周期进程的信号通路。C/EBPα在K562细胞中的促分化和诱导凋亡功能提示其将在CML的治疗中发挥较强的作用，对其表达水平的检测有可能成为肿瘤监测和预后评估的新指标。但C/EBPα-Per2信号通路在CML中的具体调控机制仍需深入研究。

参考文献

[1]FriedmanAD.Transcriptionalcontrolofgranulocyteandmonocytedevelopment[J].Oncogene，2007，26(47)：6816-6828.

[2]ShimokawaT，NunomuraS，FujisawaD，etal.IdentificationoftheC/EBPαCterminaltailresiduesinvolvedintheproteininteractionwithGABPandtheirpotencyinmyeloiddifferentiationofK562cells[J].BiochimBiophysActa，2013，1829(11)：1207-1217.

[3]FragliassoV，ChiodoY，FerrariAmorottiG，etal.Phosphorylationofserine21modulatestheproliferationinhibitorymorethanthedifferentiationinducingeffectsofC/EBPαinK562cells[J].JCellBiochem，2012，113(5)：1704-1713.

[4]孙成铭，黄世峰，罗红伟，等.CCAAT/增强子结合蛋白α对K562细胞分化和凋亡的影响及机制[J].肿瘤，2009，29(3)：220-225.

[5]GeryS，GombartAF.TranscriptionprofilingofC/EBPtargetsidentifiesPer2asageneimplicatedinmyeloidleukemia[J].Blood，2005，106(8)：2827-2836.

[6]GoldJM，MeloJV.Chronicmyeloidleukemiaadvancesinbiologyandnewapproachestotreatment[J].NEnglJMed，2003，349(15)：1451-1464.

[7]GeryS，KoefflerHP.Per2isaC/EBPtargetgeneimplicatedinmyeloidleukemia[J].IntegrCancerTher，2009，8(4)：317-320.

[8]ThoennissenNH，ThoennissenGB，AbbassiS，etal.TranscriptionfactorCCAAT/enhancerbindingproteinalphaandcriticalcircadianclockdownstreamtargetgenePER2arehighlyderegulatedindiffuselargeBcelllymphoma[J].LeukLymphoma，2012，53(8)：1577-1585.

[9]YangMY，YangWC，LinPM，etal.Alteredexpressionofcircadianclockgenesinhumanchronicmyeloidleukemia[J].JBiolRhythms，2011，26(2)：136-148.

[10]WagnerK，ZhangP，RosenbauerF，etal.AbsenceofthetranscriptionfactorCCAATenhancerbindingproteinαresultsinlossofmyeloididentityinbcr/ablinducedmalignancy[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(16)：6338-6343.

[11]FerrariAmorottiG，MarianiSA，NoviC，etal.ThebiologicaleffectsofC/EBPalphainK562cellsdependonthepotencyoftheNterminalregulatoryregion，notonspecificityoftheDNAbindingdomain[J].JBiolChem，2010，285(40)：30837-30850.

(收稿日期：2013-10-23)