不同预后重症脓毒症患者外周血单核细胞Toll样受体4表达水平与内毒素耐受的临床研究

内毒素耐受是革兰阴性菌感染时机体重要的保护机制,在内毒素休克及脓毒症的发生、发展中发挥着重要作用。%ll样受体4(TLR4)介导的脂多糖信号转导通路改变在内毒素耐受产生中起关键作用。而不同预后重症脓毒症患者外周血单核细胞TLR4和炎性因子表达及体外脂多糖刺激后TLM和炎性因子的表达情况及可能的临床意义,目前相关报道很少。本研究旨在观察不同预后重症脓毒症患者外周血单核细胞TLR4表达与内毒素耐受的关系,以进一步探讨内毒素耐受的理论和实际意义。

资料与方法

1.一般资料:选取2007年3月至2011年10月我科收治的重症脓毒症患者5例(重症脓毒症组),其中男19例,女16例,年龄33~91(70.26%±10.92)岁。均符合“国际脓毒症定义会议”推荐标准田,脓毒症指由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征,重症脓毒症为合并器官功能障碍的脓毒症。排除标准:心肺复苏术后,急性心肌梗死,恶性肿瘤晚期,血液病,在诊断为重症脓毒症之前使用过免疫抑制剂的免疫缺陷患者。另选择同期15例健康体检者作为对照组,男8例,女7例,年龄43~83(67.86±11.13)岁。两组性别构成和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.方法:(1)重症脓毒症患者均给予针对原发病的综合ICU治疗:参照《2008年严重感染和感染性休克治疗指南》的方法。(2)人住ICU后行急性生理学和慢性健康状况Ⅱ评分(APACHEⅡ)及20d后转归(死亡和存活)。(3)重症脓毒症患者人住ICU20h内、对照组体检当天各采外周静脉血10ml,其中1ml乙二酸四乙酸二钾(EDTA-Κ2)抗凝,4℃冰箱保存,⒉h内送检,流式细胞术分别测定外周血CD圹单核细胞TLR4的表达率,以平均荧光强度(M∏)表示;另取2ml离心,分离血清后胡0℃保存,酶联免疫吸附法测定血清胂瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10浓度;剩下的血液用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素、25mm。l/L Hepes)培养。重悬细胞,加人脂多糖40ug/ml,培养皿放置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度的培养箱中孵育24h,然后收集单核细胞继续培养24h后离心,分离血清,胡0℃保存,酶联免疫吸附法检测上清液中Ⅲ孓α、IL-10浓度,将剩余的细胞混匀,流式细胞仪检测TLF⒕表达。

3.统计学方法:应用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用两独立样本t检验,计数资料比较采用检验,P<0.O5为差异有统计学意义。

结果

1.预后:35例重症脓毒症患者死亡10例(死亡组),生存乃例(生存组),20d病死率为20.6%(10/35)。35例患者中,肺部感染笳例,胆道感染4例,腹部感染5例;微生物培养均阳性,其中革兰阴性菌30例,混合感染5例个脏器衰竭2例,2个脏器衰竭15例,≥3个脏器衰竭18例。

2.重症脓毒症组和对照组外周血单核细胞TLR4表达及血清TN-α、IL-10浓度比较:见表1。重症脓毒症组外周血单核细胞TLM表达显著低于对照组,血清TN-α、IL-10浓度明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。

3.不同预后组APACHEⅡ和外周血单核细胞TLRH表达比较:生存组与死亡组APACHEⅡ和外周血单核细胞TLR4表达比较差异均无统计学意义[(18.93+9.37)分比(20.75±8.67)分和(11.21±7.92)MFI比(10.15±9.70)MFI,

4.不同预后组和对照组脂多糖刺激后外周血单核细胞TLRzl表达及细胞培养上清液TNF-α、IL-10浓度比较:见表2。给予脂多糖刺激后对照组外周血单核细胞TLM表达较脂多糖刺激前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);生存组与死亡组脂多糖刺激后外周血单核细胞TLR4表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。生存组与死亡组细胞培养上清液TNF-α、IL-10浓度均显著低于对照组,但死亡组IL-10浓度显著高于生存组,差异均有统计学意义(P<0.01.p<0.05)。

讨论

脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁上主要的致病成分,能导致宿主细胞因子失控性表达,发生严重的感染和多脏器损伤。TLR4作为脂多糖的模式识别受体,在脂多糖导致的脓毒症发生、发展中起重要作用,其升高与革兰阴性菌感染密切相关臼。sdomao等臼研究结果显示TLM表达水平能评估脓毒症的严重性,在脓毒性休克患者表达最低,其次是重症脓毒症和脓毒症患者。本研究显示所有重症脓毒症患者APAcHEⅡ均在18分以上,人住ICU20h内外周血单核细胞⒒M表达均显著低于对照组,且APACHEⅡ越高,TLRH表达越低,说明体内外周血单核细胞TLRzI表达可提示患者病情的严重性,但不同预后之间比较差异无统计学意义,可能与人选例数较少有关。正常人外周血单核细胞预先受到小剂量内毒素刺激可以产生内毒素耐受现象,如果再次以大剂量的内毒素刺激,其反应性明显下降,细胞因子分泌减少,这一现象称为内毒素耐受凹。TLR4作为介导脂多糖信号转导的主要受体,其表达量和功能下调及TLR4信号通路中各个环节的功能缺陷,都将导致内毒素耐受产生,是内毒素耐受产生的重要原因之一。从脓毒症及脓毒性休克存活患者中提取的单核细胞对脂多糖具有耐受的特征,能够明显减轻“二次打击”带来的损伤,对于提高脓毒性休克患者生存率和改善预后具有积极意义囹。但也有学者认为内毒素耐受会减弱宿主的防御机制,造成更大的损伤,因内毒素耐受的同时也抑制了炎性因子的表达,不利于机体抵御微生物的人侵,所以研究不同预后重症脓毒症患者外周血单核细胞TLM表达与内毒素耐受具有重要的理论和实际意义。Med的dev和Ⅴo莎llW·究结果显示在内毒素耐受时细胞膜TLR4表达下调。Br。ad等lmJT究结果显示,内毒素耐受时,可检测到TLR4mRNA表达下降,从而使T"4表达降低,各种炎性因子表达下调;Brandl等囵研究显示脓毒症患者单核细胞在体夕卜用脂多糖(0O ng/nll)刺激后TLR4表达明显降低。本研究显示无论从生存组还是死亡组患者中提取的单核细胞在体外大剂量脂多糖刺激后TLR4表达较刺激前均显著降低,其外周血单核细胞培养上清液TN弘α、IL~10浓度也显著低于对照组(P<0。01),提示重症脓毒症患者无论生存组还是死亡组均存在内毒素耐受,大剂量脂多糖刺激后,炎性因子的产生较正常人明显减少。但死亡组⒒-10明显高于生存组,可能与死亡组患者循环血中单核细胞由于多次受到炎性因子的刺激,通过过度释放IL-10参与了免疫功能抑制的发生,而免疫抑制减弱了宿主的防御机制,可能与不良预后有关。国内藤国杰和聂秀红网研究显示,外周血单核细胞在脂多糖刺激后TLM表达无明显下降,与本研究结果不符,可能与体外脂多糖刺激的量不一致,或刺激后检测的时间及患者的病情轻重不同等有关。

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