新疆地区汉族血管紧张素转换酶基因多态性与冠心病相关性研究

　　作者：杨忠伟,冯秀丽,梁晓安,吕月萍　　作者单位：新疆生产建设兵团农七师医院心内科，新疆 奎屯

　　【摘要】 目的 探讨新疆地区汉族人群血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性与冠心病关联性。方法 应用聚合酶链反应(PCR)限制性内切酶方法检测了新疆地区汉族42例冠心病人和82例正常人群ACE基因多态性。结果 汉族正常人群的ACE基因三种基因型频率分别为：DD型19.51%，ID型32.93%，II型47.56%。D和I等位基因频率分别为36.0%和 64.0%;冠心病人的ACE基因三种基因型频率分别为：DD型28.57%，ID型30.95%，II型 40.48%。D和I等位基因频率分别为 44.05%和 55.95%，无显著性差异(χ2=1.996 8，P>0.05)，且男女之间也无显著性差异。结论 ACE基因多态性与新疆地区汉族冠心病关联性不大，但值得关注。

　　【关键词】 血管紧张素转换酶,多态性,ACE基因;冠心病

　　血管紧张素转换酶(ACE)是调节心血管和泌尿过程的肾素血管紧张素系统的关键酶之一。人类ACE基因位于17号染色体长臂q23位点，长度为21 kb，包括26个外显子和25个内含子，其中第16内含子存在一段287 bp的DNA序列的插入(I)或缺失(D)，构成ACE基因I/D多态性〔1〕。这种基因多态性分布将有助于从分子水平对心血管疾病的发病率及不同种族间的差异提供依据。国内各地关于ACE基因多态性的研究已有报道〔2～4〕，但在新疆地区尚未见系统报道。本文的研究旨在了解新疆地区汉族种族同源资源的正常人群和冠心病病人ACE基因I/D多态性分布情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　随机抽取82例新疆地区汉族无血缘关系健康人群和42例汉族冠心病病人静脉血各3 ml，抗凝，充分混匀后放入-20℃冰箱冷藏室保存待检。健康人群经检查排除冠心病、高血压、糖尿病及脑血管病。82例健康人中男47例，女35例，年龄18～62岁，平均(40.6±10.8)岁;42例冠心病人中男31例，女11例，年龄30～79岁，平均(54.5±19.4)岁。冠心病人均符合1979年WHO冠心病诊断标准且心电图检查均为陈旧性心肌梗死患者。

　　1.2 主要仪器

　　MastercyclerReppendorf PCR仪(梯度核酸扩增仪)，购自上海艾本德生物技术国际贸易有限公司;20 g/L琼脂糖凝胶电泳 EB染色上海生工生物工程有限公司试剂盒。

　　UVP AC暗箱+GEL相机凝胶成像仪，购自天美有限公司。

　　1.3 DNA的提取

　　取冷藏保存的抗凝全血2.5 ml于1.5 ml离心管(EP)中，加双蒸水振荡使红细胞破裂，15 000 r/min离心15 min，留取白色沉淀，用酚氯仿异戊醇法提取DNA：取50 μl WBC加入600 μl TES充分颠倒混匀;加入100 g/L SDS 50 μl;加入20 g/L蛋白酶K 2.5 μl，充分颠倒混匀;37℃水浴过夜;加入等体积酚(约700 μl)，颠倒混匀2 min，10 000 r/min，离心5 min，取上清液;重复上述步骤。加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)，颠倒混匀2 min，10 000 r/min，离心5 min，取上清液。加入2倍体积的冷无水乙醇(-20℃冰箱中储存的)颠倒混匀，置-20℃冰箱沉淀>30 min。12 000 r/min，离心20 min(4℃)，弃上清。加入750 ml/L乙醇1 ml，小心洗涤沉淀(弹、颠倒混匀)，12 000 r/min，离心10 min，弃上清。静置10～20 min,待管壁残留的乙醇挥发干净后，将沉淀溶于50 μl去离子水中即含DNA。

　　1.4 引物设计与合成

　　参照文献〔2〕设计引物：上游引物5′CTGGAGACTCCCATCCTTTCT3′;下游引物：5′GATGGCCATTCGTCAGAT3′。

　　1.5 PCR扩增 反应体系为15 μl，包括DNA模板0.8 μl、10× Buffer (Mg2+) 1.5 μl，dNTP Mix 1.2 μl，primer上游引物0.1 μl，primer下游引物0.1 μl，Taq polymerase 0.1 μl，纯水11.2 μl。PCR仪扩增反应条件：参数为95℃预变性2 min，95℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

　　1.6 PCR产物鉴定

　　20 g/L琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min，置凝胶成像仪上观察特异性条带，打印并记录实验结果。

　　1.7 统计学分析

　　ACE各基因型频率和等位基因频率经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验，各组间频率比较用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 电泳结果

　　经PCR反应，得到3种基因型：DD型(缺失纯合子，只含190 bp片段)，ID型(缺失与插入杂合子，含190 bp和490 bp两种片段)，II型(插入纯合子，只含490 bp片段)，结果见图1、图2。

　　2.2 新疆地区健康汉族人群ACE基因频率

　　在82例样品中，DD型 16例，ID型 27例，II型39例，三种基因型的频率分别为19.51%、32.93%和47.56%;D、I等位基因的频率分别为36.0%和 64.0%。经χ2检验，这些比例与Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=1.403 6，P>0.05)，具有群体代表性。等位基因频率分布男女间无显著性差异(χ2=0.788 3，P>0.05)。见表1。表1 新疆地区汉族健康人群ACE基因型及等位基因频率分布〔n(略)〕

　　2.3 新疆地区汉族冠心病人ACE基因频率

　　在42例样品中，DD型 12例，ID型 13例，II型17例，三种基因型的频率分别为28.57%、30.95%和40.48%;D、I等位基因的频率分别为44.05 %和 55.95%。经χ2检验，这些比例与Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.153 3，P>0.05)，具有群体代表性。等位基因频率分布男女间无显著性差异(χ2=2.268 7，P>0.05)。见表2。表2 新疆地区汉族冠心病人ACE基因型及等位基因频率分布〔n(略)〕

　　2.4 新疆地区汉族冠心病人及正常人群ACE基因频率比较

　　组间比较无显著性差异(χ2=1.303 9，P>0.05)，见表3。表3 新疆汉族冠心病人及正常人群ACE基因频率比较〔n(略)〕

　　3 讨论

　　自1990年Rigat〔2〕发现人ACE基因16内含子存在插入(I)/缺失(D)多态性后，ACE基因多态性与各种疾病的关系受到广泛关注，近年来迅速发展的分子生物学实验技术及遗传流行病学方法为疾病的易感基因研究提供了方法和手段。本文采用PCR方法研究了新疆地区汉族正常人群和冠心病人ACE基因多态性的分布特点，本研究人群基因型分布符合Hardy Weinberg遗传平衡，说明样本来自同一人群，其结果具有代表性。结果显示：新疆地区汉族正常人ACE的DD、ID、II基因型频率分别为19.51%、32.93%、47.56%，D、I等位基因的频率分别为36.0%和 64.0%;冠心病人ACE的DD、ID、II基因型频率分别为28.57%、30.95 %和40.48%;D、I等位基因的频率分别为44.05%和 55.95%。两组三种基因型频率及等位基因的频率相似，冠心病人有II基因型频率及I等位基因频率减少而DD基因型频率及D等位基因频率增加趋势，但统计无显著性差异，且男女性别之间差异均无显著意义。这可能与样本量少有关，或与其他基因多态性关联。环境因素也值得考虑。高活性的ACE被认为是某些心血管疾病、肾病、糖尿病的危险因素，研究比较国人不同民族群体的遗传特点，对于从分子流行病学角度了解ACE基因多态性在我国人群中的分布，对认识一些疾病在不同地区、不同种族表现出来的差异具有重要意义。本研究也为本地区汉族ACE基因多态性与冠心病的关系提供了理论基础。

　　【参考文献】

　　1 Rigat B，Hubert C,AlhencGdns F,et al.Aninsertion/deleton Polynerphism in the angiotensin Iconverting enigne gene Accounting for habf the variance of serwn tnigme levels〔J〕.J Din Invest,1990;86(4)：13436.

　　2 庞小芬，朱鼎良，巩方霞，等.上海地区正常人ACE基因多态性频率的分布〔J〕.高血压杂志，2001;9(4)：2946.

　　3 廖宝平，孙筱放，潘倩莹，等.广东汉族人群血管紧张素转换酶基因(ACE)多态性研究〔J〕.中国优生与遗传杂志，1999;7(4)：101.

　　4 吴红梅，屈遂林，黄 倩，等.成都地区汉族人群ACE基因多态性与血清ACE活性的相关性〔J〕.华西医科大学学报，2000;31(2)：16970