食管鳞癌组织中细胞周期素B1和D1表达的意义

作者：赵秋民,李晟磊,赵志华,刘宗文,陈奎生,高冬玲,张岚,李惠翔,张云汉

作者单位：郑州大学：1第一附属医院病理科，河南省肿瘤病理重点实验室　2郑州大学学报医学版编辑部,河南 郑州 450052

     【摘要】  目的：探讨食管鳞癌组织中细胞周期素B1和D1（Cyclin B1, Cyclin D1） mRNA和蛋白的表达及其与食管鳞癌床生物学指标的关系. 方法：应用原位杂交法、免疫组化SP法对62例食管鳞癌组织（组织学Ⅰ级15例，Ⅱ级25例，Ⅲ级22例；有淋巴结转移20例，无淋巴结转移42例；肿瘤浸润深度：浸润至黏膜层、黏膜下层或浅肌层7例，深肌层14例，纤维膜41例）、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织进行Cyclin B1，D1 mRNA和蛋白的检测，分析其阳性表达与食管鳞癌患者临床病理因素的关系. 结果：Cyclin B1，D1的mRNA和蛋白在正常食管黏膜组织中不表达或低表达，在癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中高表达，三者阳性表达率比较差异有统计学意义（P<0.05）；食管鳞癌患者癌组织中CyclinB1，D1的mRNA和蛋白的表达与性别、年龄无关；与组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移有关（P<0.05）. Cyclin B1，D1 mRNA与蛋白正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中的表达有高度的一致性. 结论：Cyclin B1，D1 mRNA和蛋白的高表达可促进食管鳞癌的发生与发展，在癌前病变期的鳞状上皮不典型增生组织中即出现高表达，是食管鳞癌发生过程中的早期事件.

【关键词】  食管肿瘤；癌，鳞状细胞；细胞周期蛋白类；免疫组织化学；原位杂交

基金项目:教育部“十五”、“211工程”重点学科建设项目(教重办200202)　　Expressions and significance of cyclin B1 and D1 in human esophageal squamous cell carcinoma

　　ZHAO QiuMin, LI ShengLei, ZHAO ZhiHua, LIU ZongWen, CHEN KuiSheng, GAO DongLing, ZHANG Lan, LI HuiXiang, ZHANG YunHan

　　1Department of Pathology, First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052, China, 2Editorial Board of Journal of Zhengzhou University (Medical Sciences), Zhengzhou 450052, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of cyclin B1 or D1 mRNA and protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissue and their relationship to the development of ESCC. METHODS: Expressions of cyclin B1 and D1 mRNA and protein were respectively detected by in situ hybridization and immunohistochemistry SP in 62 case of ESCC(15 cases of grade Ⅰ, 25 cases of grade Ⅱ, 22 cases of grade Ⅲ; 20 cases with lymph node metastasis, 42 cases without lymph node metastasis; the depth of tumor infiltration: invasion of mucosa, submucosa, or shallow layer in 7 cases, of deep muscle in 14 cases, and of fiber membrane in 41 cases), in 31 cases of paracancerous atypical hyperplasia, and in 62 cases of normal esophageal mucosa. The correlations were analyzed between the expressions and the development of ESCC. RESULTS: Cyclin B1, cyclin D1 mRNA and protein were not expressed or low expressed in normal esophageal mucosa, but high expressed in paracancerous dysplasia and esophageal cancer tissues, and the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05). Cyclin B1, D1 mRNA and protein expressions in ESCC tissues had nothing to do with the patients gender and age, but had a significant correlation with the histological grade, depth of invasion or lymph node metastases (P<0.05). Cyclin B1 and D1 expressions were quite consistent at both mRNA and protein levels in normal esophageal mucosa, paracancerous dysplasia and ESSC tissues. CONCLUSION: Cyclin B1, D1 mRNA and protein expressions can promote the occurrence and development of ESCC tissues. The expressions have been strengthened in precancerous atypical hyperplasia tissues, indicating the expressions may be the early events in the process of ESCC.

【Keywords】 esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; cyclins; immunohistochemistry； in situ  hybridization

　　0引言

　　食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，是消化道最常见的危害居民健康的恶性肿瘤之一. 有研究报道肿瘤是一类与细胞周期有关的疾病，其发生、发展和癌变与细胞周期调节失控密切相关，细胞周期调控异常导致的细胞失控性增殖是肿瘤发生和发展的重要特征［1-2］. 随着正常细胞周期和肿瘤细胞周期的深入研究，发现细胞周期素B1（CyclinB1）,细胞周期素D1（CyclinD1）的异常表达与多种肿瘤的发生、发展相关［3-4］. 有学者分别在食管癌组织中应用免疫组化方法单独检测了CyclinD1和CyclinB1的表达情况［5-7］，而二者在食管癌中的联合检测国内外未见文献报道. 为此，我们采用免疫组织化学方法和原位杂交技术联合检测食管鳞状细胞癌组织、相应癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中CyclinB1,D1蛋白和mRNA的表达情况，并分析其与食管鳞癌临床生物学指标的关系.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　20060226/0316食管癌高发区河南省安阳市肿瘤医院择期手术切除的食管癌标本62例，术前均无化放疗及免疫治疗史. 男36例，女26例，年龄38～75 (60.6±7.5) 岁. 全部标本均在离体30 min内分别于癌灶、癌旁3 cm以内及手术残端食管组织3处迅速取材，组织经40 g/L多聚甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度3～5 μm，分别用HE，免疫组织化学及原位杂交染色. HE切片经病理组织学证实62例癌标本均为鳞癌，组织学分级：Ⅰ级15例，Ⅱ级25例，Ⅲ级22例；伴淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者42例；肿瘤浸润深度：浸润至黏膜层、黏膜下层或浅肌层7例；深肌层14例，纤维膜41例. 癌旁3 cm以内的标本中经病理组织学证实31例呈中重度不典型增生，作为本研究的观察对象. 手术残端食管组织（62例）经病理学证实均为正常鳞状上皮. CyclinB1，D1鼠抗人mAb分别购于上海长岛生物技术有限公司和北京中杉金桥生物技术有限公司. SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司. CyclinB1，D1原位杂交5＇端生物素标记、全硫代修饰探针由北京奥科生物技术有限公司合成.

　　1.2方法

　　免疫组织化学染色采用SP法，操作严格按说明书进行. 石蜡切片常规脱蜡和水化后，浸于EDTA液（pH 9.5），高压修复组织抗原20 min. PBS洗涤；封闭内源性过氧化物酶；PBS洗涤；非免疫性动物血清孵育10 min；CyclinB1，D1 mAb孵育60 min（工作浓度1∶100）； 生物素标记的第二抗体孵育10 min；PBS洗涤；链霉素标记的亲和素过氧化物酶孵育10 min；PBS洗涤；DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 以PBS液代替Ⅰ抗作为阴性对照，阳性对照为已知Cyclin B1，D1蛋白表达阳性的乳癌、肺癌组织切片. 另切片经新鲜配制二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后，用新鲜配制的体积分数为5 mL/L H2O2室温处理30 min，灭活内源性过氧化物酶；30 g/L柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01 g/L)，37℃，10 min，消化标本DNA结合蛋白；每张玻片滴加20 μL不含cyclin B1，D1探针的预杂交液(42℃)，预杂交4 h；加含探针(1 g/L)的杂交液，42℃湿盒内杂交12 h；0.1×标准柠檬酸盐(SSC) 42℃洗后，加SABioAP 37℃，10 min；漂洗后加BCIP/NBT显色剂，避光显色0.5 ~2 h. 以不含CyclinB1，D1探针的标本作阴性对照. 食管鳞癌组织中CyclinB1蛋白阳性细胞主要表达于胞质，部分定位于胞核，呈黄色或棕黄色颗粒样信号；CyclinD1蛋白阳性信号定位于胞质，呈黄色或棕黄色颗粒. 结果判断如下［6-8］：①根据阳性细胞在同类细胞中所占比例计分：阳性细胞<10%计0分；10%~25%计1分；26%~50%计2分；>50%计3分. ②按阳性细胞染色强度计分：不着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分. 2项相加0~1分为阴性，2~3分为+，4~5分为，6分为（>4分为过表达，计为阳性）. 食管鳞癌组织中CyclinB1 mRNA阳性细胞主要表达于胞质，部分定位于胞核，呈蓝紫色颗粒样信号；CyclinD1 mRNA阳性信号定位于胞质，呈蓝紫色颗粒.

　统计学处理:  应用SPSS10.0统计学软件，统计分析方法为χ2检验和Spearman相关性分析. 检验水准为0.05.

　　2结果

　　2.1食管黏膜组织中CyclinB1,D1蛋白的表达鳞癌组织中，CyclinB1和CyclinD1阳性细胞分布在细胞增生活跃区，如癌细胞珠的周边区域或呈中、低分化的癌细胞团内，而且着色较深，癌细胞珠中央区则无阳性表达（图1A,图2A）. 癌旁不典型增生组织中的染色和定位区域类似与癌组织. 正常食管黏膜组织中仅有少量CyclinB1, CyclinD1阳性表达，且这种表达多位于靠近基膜的2~3层基底细胞（图1B,图2B）. 组织中CyclinB1和CyclinD1阳性表达与组织分化程度有较高的一致性，表达从正常鳞状上皮癌旁不典型增生鳞癌组织依次增高(表1). 不同性别、年龄间CyclinB1,D1蛋白的表达差异无统计学意义，而不同组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移间CyclinB1,D1蛋白的表达差异有统计学意义（表2）.表1食管黏膜组织中CyclinB1,D1蛋白的表达(略)表2CyclinB1,D1蛋白表达与食管鳞癌临床生物学的关系(略)

　　2.2食管黏膜组织中CyclinB1,D1 mRNA的表达正常食管黏膜组织中仅有少量CyclinB1, CyclinD1 mRNA的阳性表达，且这种表达多位于靠近基膜的基底细胞（图3A）. 鳞癌组织中阳性细胞分布在细胞增生活跃区，如癌细胞珠的周边区域或呈中、低分化的癌细胞团内，而且着色较深（图3B,3C）. CyclinB1和CyclinD1在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中的阳性变化有统计学意义(P<0.05,表3). 不同性别、年龄间CyclinB1,D1 mRNA的表达差异无统计学意义，而不同组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移间CyclinB1,D1 mRNA的表达差异有统计学意义（表4）. 另外，食管鳞癌组织中CyclinB1,D1蛋白和mRNA表达成正相关，相关系数分别为0.801和0.756（P<0.05）.表3食管黏膜组织中CyclinB1,D1 mRNA的表达(略)表4CyclinB1,D1 mRNA表达与食管鳞癌临床生物学的关系(略)

　　3讨论

　　随着正常细胞周期和肿瘤细胞周期的深入研究，许多学者认为在肿瘤的发生中细胞生长周期的失调起重要作用，Cyclin的异常表达与多种消化道肿瘤的发生、发展有关，且对肿瘤的恶性生物学行为及肿瘤的预后有重要意义［1-3］. 作者选择在细胞周期的G1期起主要作用的CyclinD1以及在G2期起主要作用的CyclinB1，探讨它们在食管鳞癌中的表达情况及临床病理学意义.

　　CyclinD1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白. 当细胞受到生长因子的刺激时CyclinD1合成，并且与细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependentkimase,CDK) 4或6结合，形成CyclinD1CDK4或CyclinD1CDK6复合物，从而使CDK活化，促进细胞由G0期进入G1期. 当cyclinD1基因扩增、重排或过表达时，CyclinD1CDK复合物增多，从而介导Rb基因蛋白磷酸化和癌基因p21高表达，并促进细胞增殖，进而形成肿瘤. 我们发现，从正常鳞状上皮癌旁不典型增生鳞癌组织，CyclinD1蛋白和mRNA的阳性表达率逐渐上升. 本研究结果与韩彪等［7-8］报道相符. 研究结果还显示， CyclinD1蛋白的过表达与其基因扩增及mRNA转录水平的增加基本平行一致， 说明CyclinD1基因扩增和转录水平的提高多将导致其蛋白的过表达.

　　CyclinB是控制细胞进入G2/M期的关键因子. CyclinB1是所有细胞周期素中惟一一个随细胞周期改变而发生位置转移的细胞周期素. 它在分裂间期完全处于胞质中，且大多数分布在核膜周围. 其定位受细胞质滞留信号(CRS)影响. 我们发现CyclinB1 mRNA的阳性表达主要分布在细胞核内，部分阳性细胞的核膜周围出现较大、颜色较深的蓝紫色颗粒，可能与上述报道的机制有关.

　　综上所述，我们认为CyclinB1,D1的蛋白和mRNA过表达可促进食管鳞癌的发生与发展，在癌前病变期的鳞状上皮不典型增生组织中即出现二者蛋白和mRNA高表达，提示二者是食管鳞癌发生过程中的早期事件.

【参考文献】  　　［1］张雷,张才全. Cyclin B1与肿瘤发生发展［J］.第三军医大学学报,2003,25(18):1676-1678.

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　　［5］许燕云,刘标,唐慰萍,等.散发性乳腺癌中BRCA1和cyclinB1的表达［J］.临床与实验病理学杂志,2004,20(3):273-276.

　　［6］李吉学,何欣,王立东,等.河南食管癌高发区居民食管癌和癌旁组织细胞周期素D1蛋白和mRNA的表达［J］.河南医学研究,2003,12(3):197-200.

　　［7］韩彪,张现伟,刘健,等. pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌中的表达［J］.肿瘤防治研究,2006,33(9):649-652.

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