流式细胞术对食管癌、贲门癌患者T细胞亚群的分析
发表时间：2009-06-24 浏览次数：730次
【摘要】 目的 采用流式细胞术方法检测食管癌、贲门癌患者细胞免疫功能。方法 应用三色免疫荧光流式细胞仪测定145名食管癌和贲门癌患者及18例正常对照者外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、CD4+/CD8+比值。结合临床病理结果探讨二者之间的关系。结果 (1)食管癌、贲门癌患者外周血中CD8+T淋巴细胞比例较正常对照组明显升高（P＝0.030）；CD3+、CD4+亚群较正常值降低，但是没有统计学差异。NK细胞两组比较也没有显著性差异；(2)早期（0、Ⅰ期）食管癌、贲门癌病人和健康对照组之间T细胞各亚群相比没有统计学差异；中、晚期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）食管癌、贲门癌病人和健康对照组相比：CD4+明显降低（P＝0.023）；CD8+则明显升高（P＝0.021）；CD4+ /CD8+较正常有所下降，但是没有显著性差异；淋巴结阴性患者和淋巴结阳性患者比较T细胞各亚群没有明显差异。结论 外周血T细胞亚群的检测有助于提高对食管癌患者的病情，临床分期以及机体免疫状态的判断，晚期食管癌患者机体免疫状态成紊乱型改变。
【关键词】 食管癌 贲门癌 T细胞亚群 流式细胞术 临床分期
0 引言
恶性肿瘤患者往往伴有机体免疫机能低下和紊乱，免疫机能低下和紊乱对肿瘤发生发展起到一定的作用。流式细胞术分析T细胞亚群具有快速、多参数、可定量、操作简便等优点，国外已有较多报道。食管癌、贲门癌患者的机体免疫状态尤其是细胞免疫状态国内已有报道，但所用研究方法多为传统的免疫细胞学方法。本研究通过三色免疫荧光流式细胞术分析145名食管癌、贲门癌患者外周血T细胞亚群，并结合临床病理分期，分析食管癌、贲门癌患者细胞免疫状态的改变及其临床意义。
1 资料和方法
1.1 资料和方法
收集2004年6月～2005年8月在我科住院治疗的145名食管癌及贲门癌患者，所有病例抽血化验前均未行放、化治疗，并均经胃镜活检证实诊断。年龄29～85岁，男性105名，女性40名，平均年龄61.03岁。食管癌116例，贲门癌29例。病理类型食管癌鳞癌113例，贲门癌腺癌28例，食管腺鳞癌2例，贲门腺鳞癌1例，食管小细胞癌1例。其中127名患者经手术治疗并有相应的术后病理结果。18名患者未行手术治疗（转放疗科8人，转内科5人，其他原因未治出院5人）。以18名健康成年人作为对照组。145名患者和健康对照组于入院进行治疗之前清晨空腹抽静脉血2ml,EDTA钾盐抗凝。获得标本后立即送检。
1.2 肿瘤分期
肿瘤分期根据CT、胸片、腹腔B超及手术后病理结果采用UICC的TNM分期标准，其中0期原位鳞癌1例；Ⅰ期16例；Ⅱ期59例；Ⅲ期47例；Ⅳ期4例；没有分期资料18例。
1.3 试剂和仪器
试剂：美国Couter公司进口试剂，包括CD4－FITC／CD8－PE／CD3－Percp三色标记的单克隆抗体。仪器：美国Couter 公司Epics Xl型流式细胞仪。
1.4 三色免疫荧光染色
取CD4－FITC／CD8－PE／CD3－Percp三色标记的单克隆抗体20μl加入试管管底，加入待检验的经EDTA钾盐抗凝的全血50μl，混匀，避光室温下染色15min。然后加入OptilyseC 溶血素500μl，充分混合后立即上机检测。
1.5 流式细胞仪分析
使用Couter 公司配套的System Ⅱ系统软件数据处理系统。先进行光路流路的较准，较准后进行荧光补偿，然后上样本检测。
1.6 统计学分析
检测结果以均数±标准差表示。利用SPSS10.0处理试验结果，两组之间均数比较采用独立样本的双侧t检验，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 T细胞亚群
CD3+、CD4+亚群较正常值降低，但是没有统计学差异。NK细胞两组比较也没有显著性差异，表1。表1 食管、贲门癌患者和正常对照组T细胞亚群比较食管癌、贲门癌患者外周血中CD8+T淋巴细胞比例较正常对照组明显升高（P<0.05）
2.2 T细胞亚群和临床病理分期的关系
2.2.1 早期病人和健康对照组T细胞亚群比较 早期食管癌、贲门癌病人和健康对照组之间T细胞各亚群相比没有统计学差异，见表2。表2 早期患者和健康对照组T细胞亚群比较
2.2.2 中、晚期食管癌、贲门癌病人和健康对照组T细胞亚群比较 CD4+ /8CD+较正常有所下降，但是没有显著性差异，见表3。表3 中、晚期患者和健康对照组T细胞亚群比较中、晚期食管癌、贲门癌病人和健康对照组相比：CD4+明显降低；CD8+则明显升高（P<0.05）
2.2.3 淋巴结阴性病人和淋巴结阳性病人T细胞亚群比较 淋巴结阴性患者和淋巴结阳性患者各T细胞亚群比较无显著性差异。表4 淋巴结阴性组和淋巴结阳性组比较注：6例探查病人按淋巴结阳性处理
3 讨论
机体抗肿瘤免疫效应以细胞免疫为主,T细胞介导的细胞免疫在机体抗肿瘤效应中起重要作用。根据T细胞表面分化抗原的不同，T细胞主要可以分为两大类：CD4+和CD8+T淋巴细胞。CD4+主要是辅助性T淋巴细胞（Th）, CD8+包括细胞毒T淋巴细胞（CTL）和抑制性T淋巴细胞（TS）。CD4+T淋巴细胞在抗肿瘤细胞免疫中发挥核心的作用。通过抗CD4+抗体或者CD4+基因敲除动物试验研究显示：缺乏CD4+T淋巴细胞的试验动物不能产生抗体特异性的CD8+T淋巴细胞［1，2］，而且CD4+T细胞通过分泌的IL2等细胞因子对于CD8+T淋巴细胞功能的维持是不可缺少的［3］。显然，机体通过CD4+T淋巴细胞来达到调节细胞免疫功能的目的。恶性肿瘤患者CD4+T细胞亚群的改变情况报道不一，但多数研究CD4+T细胞亚群在恶性肿瘤患者中减少［4，5］。本研究虽然中晚期食管癌患者CD4+T细胞明显降低，但在早期，CD4+T细胞的改变无明显的统计学差异。已知淋巴细胞的数量不是由淋巴干细胞生产的多少来决定的，而是通过成熟淋巴细胞自我稳定性的增殖进行调控［6，7］。早期，机体自稳定机制尚可以发挥作用，当CD4+T细胞减少时，即很快出现CD4+T细胞增殖从而保持相对的稳定。由于早期没有明显的免疫功能变化，提示肿瘤细胞能够逃脱免疫破坏而得以发生、发展。本研究显示：CD8+T细胞在患者体内明显高于对照组。由于目前国内多数单位开展的T细胞亚群检测只是检测各亚群的比例而不是绝对值，因此，可能存在两种原因：一是由于CD4+T淋巴细胞比例减少，相应地导致CD8+T淋巴细胞比例增加；二是CD8+T淋巴细胞绝对值增加。对于第一种可能性，进一步开展T细胞亚群绝对数量的测定可以明确；对于第二种可能，有学者认为CD8+T淋巴细胞可以根据功能进一步分为抑制性T淋巴细胞（TS）和细胞毒T淋巴细胞（TC），晚期肿瘤患者存在抑制性T淋巴细胞（TS）的增加。由于目前区分TS和TC尚有一定困难，需进一步研究证实。
机体肿瘤免疫是抗肿瘤细胞免疫和肿瘤免疫抑制、免疫逃避之间的平衡。CD4+T细胞所占比例的下降必然导致CD8+T细胞比例的增加，从而形成CD4+／CD8+比值的下降。Dick等［8］认为：CD4+／CD8+的比值可以反映机体的抗肿瘤免疫状态，大致反映上述两者之间的平衡关系。晚期肿瘤患者外周血中CD4+／CD8+比值下降，甚至比值倒置，说明患者免疫处于抑制状态。本研究显示：食管癌、贲门癌患者CD4+／CD8+虽然有下降但无统计学意义。在Dick研究对象多为远处转移的晚期患者，本文研究对象均为外科待术的病人，145名患者中只有4例Ⅳ期病人，这种研究对象构成的差异导致了不同的结果。
NK细胞对肿瘤具有非特异性的杀伤作用，被认为是机体抗肿瘤免疫的第一道防线。不需要致敏即可发挥对肿瘤细胞的攻击作用。近年来研究表明：NK细胞不仅在非特异性抗肿瘤免疫中发挥重要作用，并且具有激活和增强树突状细胞的功能，因此，NK细胞起到连接非特异性免疫和特异性免疫的作用［9］。但是，由于NK细胞在细胞毒淋巴细胞中所占比例很小［10］，并且在外周血淋巴细胞中只占15％［11］，所以目前认为其在抗肿瘤的细胞免疫中的作用没有T淋巴细胞突出。本研究显示：食管癌、贲门癌患者的NK细胞和健康对照组没有明显差异。
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