宁夏一起风疹暴发的病原学调查分析

作者：陈慧,詹军,周莉薇,孙晓强作者单位：宁夏回族自治区疾病预防控制中心，银川 750004

【摘要】  为了解宁夏一起流行风疹病毒的基因型，采用间接ELISA法测定病人急性期血清风疹IgM抗体；采用病毒分离法分离急性期病人咽拭子中的风疹病毒，使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测分离的风疹病毒E1基因，并对扩增产物进行分析鉴定。结果，检测病人血清RV-IgM抗体的阳性率为100%。用病毒分离和RT-PCR法首次分离到宁夏流行风疹病毒，序列分析结果表明此次风疹流行株的基因型属于1E基因型。

【关键词】  风疹病毒；血清学诊断；病毒分离；基因型鉴定

　　风疹是由风疹病毒引起的经呼吸道和胎盘传播的急性呼吸道传染病。其危害在于先天性感染所致的先天性心脏畸形、耳聋、发育障碍等先天性风疹综合征（CRS）和风疹后脑炎，人类是其唯一宿主［1］。截至1998年，全球115个国家已制定了消除麻疹的目标。2005年中国所在的世界卫生组织（WHO）西太平洋区提出2012年消除麻疹的目标。但由于麻疹与发热出疹性疾病特别是风疹临床难以鉴别，致使许多风疹病例误报为麻疹，直接影响了麻疹发病率的真实水平。因此，对儿童初期出疹性疾病的实验室鉴别诊断和病原学监测显得十分必要。2006年4月我区某镇一小学报告发生“疑似麻疹暴发”。为核实诊断我们对采集的15份急性期病人血清用间接ELISA法同时检测病人麻疹、风疹IgM抗体，最终确诊为风疹暴发。同时为了解我区流行风疹病毒的基因型，我们又对采集的6份发病早期病人的咽拭子标本进行了病毒分离和基因型鉴定。现就此次结果报告分析如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  资料来源  根据现场流行病学调查资料。

　　1.2  标本来源  血清和咽拭子标本均采自该小学暴发点病人。15份血液标本于病人出疹后1～21d采集，分离血清后及时测定麻疹、风疹IgM抗体；6份咽拭子标本于病人出疹后1～3d内采集，采集后存放于3mL含5%胎牛血清的MEM中。所有标本均在4～8℃保存和运输，咽拭子标本置-70℃保存备用［2］。

　　1.3  细胞来源  VERO/SLAM细胞由中国疾病预防控制中心国家麻疹实验室提供。

　　1.4  麻疹、风疹IgM抗体测定  使用德国维润赛润试剂盒，采用间接ELISA法。具体方法按试剂盒说明书进行。

　　1.5  风疹病毒分离方法  将咽拭子标本冻融后震荡，再将棉拭子在管壁反复挤压后取出，加入终浓度为1000U/mL的双抗，置4℃冰箱作用1h后接种。接种方法详见文献［2-3］。盲传3代未发生细胞病变（CPE）的标本直接送国家麻疹实验室。

　　1.6  风疹病毒株鉴定  风疹病毒分离物送中国疾病预防控制中心国家麻疹实验室进行进一步鉴定、分析。国家麻疹实验室提取送检风疹毒株的病毒RNA，用特异的PCR引物扩增E1基因，对PCR阳性产物的核苷酸片段进行序列测定和分析。

　　2  结果

　　2.1  流行病学特征  该小学有6个年级，22个班，1431名学生。经流行病学调查，共有17个班的169名学生发病，最小年龄为6岁，最大年龄12岁，罹患率为11.31%。大部分病例主要集中在1、2年级的5个班。首发病例从2006年3月15日起，至4月6日结束，流行持续20d。

　　2.2  临床特征  多数病例出现程度不同的颜面、颈部、躯干的红色斑丘疹和耳后淋巴结肿大，并伴有发热、结膜炎和咳嗽等症状的临床表现。病程为5d左右。大多数病例皮疹与发热并行出现，且2～3d消退，出疹顺序多为从颜面到躯干及四肢。所有在校学生均于2005年11月进行过麻疹疫苗强化免疫。

　　2.3  麻疹、风疹IgM抗体测定结果  采集的15份病人血清经用间接ELISA方法同时测定麻疹和风疹IgM抗体，结果麻疹均为阴性，风疹均为阳性。风疹血清学抗体阳性率为100%，证实此次为风疹暴发。

　2.4  病毒分离结果  采集的6份咽拭子标本，在VERO/SLAM细胞上经盲传3代后均未出现可见的CPE。

　　2.5  风疹病毒鉴定结果  经对6份风疹病毒分离物E1基因片段扩增和序列测定，分析证实为1E基因型。

　　3  讨论    　　全球控制麻疹已经取得显著进展，因而WHO在继消灭脊髓灰质炎之后，正计划从控制麻疹进一步转向全球范围内消除麻疹。随着这一工作的深入，需与之鉴别诊断的另一出疹性疾病—风疹也受到了人们的关注。风疹病毒对妊娠期妇女的影响和导致胎儿的CRS所造成的后果严重,所以参与制定消除麻疹目标的国家和地区也正在考虑将接种风疹疫苗特别是对育龄期妇女的接种及风疹的实验室监测纳入国家免疫规划，以防止CRS的发生。    　　WHO建议将风疹和CRS的实验室监测纳入麻疹实验室网络中。如何能够方便、准确、快速地检测风疹病毒感染成为麻疹实验室网络中的重要课题之一 。风疹和麻疹是发热出疹性疾病的常见病因，在临床表现上很难区分，因此确诊主要依赖于特异性的实验室诊断。ELISA法是一种快速简便的诊断方法，目前国外已有多家公司生产的风疹诊断试剂盒上市，方法敏感、特异、用时短［4］，但因价格昂贵，我国许多基层实验室在经济上难以承担，致使许多病例不能及时诊断而导致误诊。所以尽快研发我国高质量的风疹ELISA诊断试剂盒在实验室鉴别诊断方面就显得十分迫切。    　　病毒分离主要是用于开展分子流行病学研究，鉴定病毒基因型，识别病毒来源和确定传播途径。应用VERO/SLAM细胞不仅能分离麻疹病毒，同时也能进行风疹病毒的分离。虽然风疹病毒可以在多种细胞上繁殖生长，但是在培养过程中遇到的最主要问题是即使细胞感染了高滴度的病毒，也不会产生CPE或CPE不明显 ，容易被忽略。所以，对盲传3代仍为阴性的标本需通过检测病毒核酸进行进一步鉴定。    　　细胞培养中分离病毒最为关键的是正确及时采集合适的咽拭子标本。风疹病毒分离最好在出疹后1～3d采集标本，出疹3d后采集的标本则很难分离到病毒［2-3］。我区对这起风疹暴发病例所采集的6份咽拭子标本因采样及时、方法正确，分离后鉴定结果均为阳性。    　　风疹病毒以E1基因核苷酸序列为指标，主要分为2个基因型［5］。此次宁夏首次分离到的风疹病毒为1E基因型。开展中国风疹病毒监测和建立毒株库及基因数据库，将为鉴定病毒的起源地和传播链提供依据，对风疹的控制及消除十分必要。宁夏乃至全国的风疹病毒分离和分子流行病学研究工作刚刚开展，此次我区风疹病毒的首次成功分离和基因型鉴定，为今后进一步搞清我区风疹病毒优势株和流行株类型奠定了良好的基础。

【参考文献】   　［1］ 迮文远.风疹的免疫预防.计划免疫学［M］.上海：上海科学技术文献出版社，1997.454.

　　［2］ WHO. Manual for the Laboratory Diagnosis of Measles Virus Infection［S］.December 1999.

　　［3］ 孙英杰，余宏杰，马艳，等.麻疹病人不同标本的麻疹病毒分离结果［J］.中国计划免疫，2002，8(1)：11-13.

　　［4］ 刘明军.风疹病毒感染的实验室诊断进展［J］.国外医学病毒学分册，2005，12（3）：68-69.

　　［5］ 可美毓.风疹病毒分子生物学研究进展［J］.微生物学免疫学进展，2006，34（2）：48-53.