PGP9.5 和CGRP 在骨关节炎患者后十字韧带中的分布

　　作者：翟饶生，王启东，池内昌彦，谷俊一 作者单位：1.佳木斯大学附属第一医院骨外二科，黑龙江 佳木斯 154003;2.高知大学医学部 整形外科

　　【关键词】 后十字韧带;蛋白基因产物 9.5 (PGP 9.5 ); 降钙素基因相关肽( CGRP );骨关节炎;神经分布

　　骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，其主要的临床表现为关节疼痛和运动功能障碍。神经系统在疼痛的产生和传导上起着至关重要的作用。了解关节周围的神经分布将对骨性关节炎疼痛的病因和治疗起到重要的指导作用。因此在本实验中，我们应用免疫组化ABC法，特异性检测人后十字韧带中的降钙素基因相关肽(CGRP) 和蛋白基因产物 9.5 (PGP 9.5 )免疫阳性神经纤维分布特征。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本选择

　　实验中的标本取自3例骨关节炎患者的后十字韧带，其中男1例，女2例;年龄74～ 85岁。对照组的标本取自3例前十字韧带损伤的患者，其中男2例，女1例，年龄16～42岁，所用有患者都于手术前通知本实验目的，并得到患者的同意。

　　1.2 方法

　　1.2.1 切片制备

　　所有的标本经手术取出后立即置于4%多聚甲醛液中，于4℃下固定24h。之后浸泡于30% 蔗糖中24h，OCT包埋。 恒冷箱切片(-20℃)下制成16μm厚的切片。最后于-80℃的冰箱中保存，备用。

　　1.2.2 免疫组化ABC法

　　首先在切片上滴加含有0.3% H2O2的甲醇溶液，浸泡10min以阻断内源性过氧化物酶。然后在3%的山羊血清中孵育30min以阻断非特异性抗原。再分别滴加兔抗人一抗CGRP(1：1000，santa cruz biotechnology)或 PGP9.5(1：1000， Abcam)，室温下孵育4h。后滴加第二抗体羊抗兔IgG(1：1000，invitrogen)室温下孵育30min。滴加AB复合物，37℃孵育30min，再在液DAB(0.05% DAB,0.006% H2O2,pH7.4) 中显色。于每步之间，切片在0.01mol/L phosphate buffer saline(PBS)液，pH7.4，中漂洗三次，每次5min。最后苏木素复染,常规脱水,透明,封片。阴性对照组用PBS液代替兔抗人CGRP多克隆抗体。阳性对照标本为正常的后十字韧带。

　　1.2.3 结果判断

　　光学显微镜下观察两组后十字韧带中两种肽能神经的分布情况。在每张切片上随机选取 6个不同的 100倍视野，进行免疫阳性神经纤维计数。结果以密度形式表达。

　　1.3 统计学分析

　　应用 SPSS 16.0统计软件进行分析,分别计算出各组数据均数和标准误,以均数±标准误表示,并进行组间差异性比较,用 t检验，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 正常后十字韧带中免疫阳性神经纤维的分布

　　在正常的后十字韧带组织中，可见少量的PGP9.5 和CGRP免疫阳性神经纤维(1.37±0.15;0.22±0.035)，且神经纤维主要分布在血管周围。在浅表面疏松结缔组织中，有大量的血管分布，有的免疫阳性神经纤维分布在血管旁，有的神经纤维穿越入血管壁(图2，3)。在远离血管的韧带中仍可见神经纤维分布。在韧带的深部组织中，血管数量相对减少，神经纤维也随之明显减少。在近关节端，神经纤维的分布密度高于其他部位。

　　2.2 骨关节炎后十字韧带中免疫阳性神经纤维的分布

　　在骨关节炎组中，后十字韧带可以见到明显的退行性化变现，胶原纤维排列紊乱，部分断裂变形。在浅表面疏松结缔组织中，血管数量明显减少，在韧带深层组织中偶可见血管。PGP9.5 和CGRP免疫阳性神经纤维密度显著减少(0.66±0.08;0.09±+0.02)，与对照组呈显著性差异(P<0.05，图1)。PGP9.5免疫阳性神经纤维的密度为对照组的48%， CGRP免疫阳性神经纤维的密度为对照组的40%。CGRP免疫阳性纤维减少的程度高于PGP9.5免疫阳性纤维。

　　降钙素基因相关肽(CGRP)存在初级感觉系统中，对伤害性感觉信息的传递起着重要的作用，是很好的感觉神经纤维标记物。蛋白基因产物 9.5( protein gene product 9.5, PGP9.5)存在所有传入和传出神经纤维中2，3。是一个非常好的泛神经标记物,对神经纤维特异性强。本体感受器对关节的位置感和运动调节起着重要的作用。现已证明，在韧带中，本体感受器数量随着年龄的增加而逐渐减少[4]。但在骨关节炎中，关于神经纤维的数量的变化，各家报道各不相同[5]。　　本实验中，在滑膜组织中可见大量的血管和PGP9.5和CGRP免疫阳性神经纤维存在。在骨关节炎组中，PGP9.5和CGRP免疫反应阳性神经纤维显著少于正常后十字韧带中的神经纤维，血管数量也明显减少。在近关节骨端，神经纤维的分布密度明显高于其他部位，这可能与近关节端血供丰富，新陈代谢活跃有关。 在骨关节炎患者中，CGRP免疫阳性神经纤维减少的程度(60%)高于PGP9.5免疫阳性神经纤维(52%)。并比正常后十字韧带中的CGRP免疫阳性神经纤维显著减少。说明骨关节炎患者的后十字韧带中CGRP 免疫阳性神经纤维，在关节的疼痛的产生和传递中并不起主导作用。我们希望通过本实验能为在骨关节炎的治疗，尤其是TKA 中，提供一些有意义的帮助。

　　【参考文献】

　　[1]Hokfelt T, Millhorn D, Seroogy K,et al.Coexistence of peptides with classical neurotransmitters[J].Experientia,1987，43(7):768780

　　[2]Gulbenkian S,Wharton J，Polak JM.The visualization of cardiovascular innervations in the guinea pig using an antiserum to protein gene product 9.5(PGP 9.5)[J].A Auton Nerve Syst,1987，18:22352247

　　[3]Kleinbart FA, Bryk E, Evangelista J,et al.Histologic Comparison of Posterior Cruciate Ligaments From Arthritic and Age-matched Knee Specimens[J].The Journal of Arthroplasty Vol, 1996，11(6)：726

　　[4]Balogun JA,Akindele KA,Nihinlola JO,et al.Age-related changes in balance performance[J].Disabil Rehabil,1994,6(2)：5862

　　[5]Niissalo S, Li TF, Santavirta S,et al.Dense innervation in pseudocapsular tissue compared to aneural interface tissue in loose totally replaced hips[J].J Rheumatol，2002，29(4):796