当归多糖对气道上皮细胞损伤后修复的影响
发表时间：2010-04-07 浏览次数：655次
作者：王群 作者单位：443611 湖北，秭归沙镇溪中心卫生院 【摘要】 目的 研究当归多糖对气道上皮细胞损伤后修复的影响，并初步研究其具体的分子机制。方法 采用气道上皮细胞划痕损伤模型。结果 发现当归多糖在5~50 ng/ml的浓度范围内对损伤气道上皮细胞有显著的促修复作用，且该作用随着浓度的递增而逐步增强，100 ng/ml的当归多糖则对损伤气道上皮细胞的修复有显著抑制作用。当归多糖可显著促进气道上皮细胞EGF的合成，且损伤气道上皮细胞上清液EGF含量与细胞损伤面积显著负相关(相关系数γ=-0.994，P<0.05)。结论 本研究提示当归多糖对损伤气道上皮细胞的促修复作用可能通过其促进气道上皮细胞EGF的合成有关。
【关键词】 当归多糖;气道上皮细胞;损伤修复;表皮生长因子
气道上皮损伤及异常修复是慢性气道疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)发生气道重构的主要原因之一[1，2]，所以促进气道上皮损伤的正常修复尤为重要。当归多糖是当归的主要成分，它作为免疫调节剂和抗放射损伤剂已在临床得到应用。最近有研究发现当归多糖可通过减少过氧化损伤保护肠道黏膜[3]，另一研究显示当归多糖对胃上皮细胞损伤后的修复具有促进作用[4]，但对于当归多糖是否可以促进气道上皮细胞损伤后的修复目前尚未明确。为此，本研究采用人气道上皮细胞系NCI-H292细胞，探讨当归多糖对该细胞损伤后修复的影响，并初步研究其具体的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂 人气道上皮细胞系NCI-H292细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司，GBICO RPMI 1640细胞培养基购自杭州伟孚生物公司。人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司。重组人EGF购自美国Peprotech公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 NCI-H292细胞置于含10%胎牛血清、50 μ/ml青霉素、50 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养，每2天更换一次培养液，每4~5天以1∶3比例传代一次。当归多糖参照文献[4]提取。
1.2.2 细胞划痕损伤模型的构建 NCI-H292细胞接种于6孔细胞培养板培养，待细胞融合度达到100%时，采用200 μl移液器枪头沿培养孔最大横径划过，然后倒置显微镜下拍照，损伤后细胞换用含低浓度胎牛血清(1%)的培养基培养，细胞损伤面积大小采用图像分析软件(Scion Image 4.12)分析，细胞损伤后最初的损伤面积大小定为1，并计算细胞损伤24 h后的损伤面积与最初的损伤面积的比值。
1.2.3 当归多糖对损伤气道上皮细胞的干预 细胞损伤后倒置显微镜下拍照，换用含低浓度胎牛血清(1%)的培养基培养，分别加入不同浓度的当归多糖(当归多糖干预的浓度梯度为0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)进行干预，并以EGF干预为阳性对照(加EGF 10 ng/ml，参考文献[5]设置EGF干预浓度)，分别干预24 h后再次显微镜下拍照，并图像分析软件分析损伤面积。选择对损伤气道上皮细胞的促修复作用较明显的3个当归多糖干预浓度细胞及阴性对照组(0 ng/ml)细胞上清液，ELISA检测干预24 h后细胞上清液EGF的浓度，操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Spearma相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 当归多糖对气道上皮细胞损伤后修复的影响 0 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml，25 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml ，EGF(10 ng/ml)的当归多糖干预下，气道上皮细胞损伤24 h后细胞损伤面积分别为0.81±0.04，0.71±0.05，0.56±0.09，0.28±0.03，0.15±0.03，0.91±0.05，0.17±0.02。EGF及5~50 ng/ml当归多糖干预组与不干预组(0 ng/ml)比较均差异有统计学意义(P<0.05)，100 ng/ml当归多糖干预组与不干预组(0 ng/ml)比较差异有统计学意义(P<0.05)。EGF干预组与50 ng/ml干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。研究结果表明当归多糖在5~50 ng/ml的浓度范围内对损伤气道上皮细胞有显著的促修复作用，且该作用随着浓度的递增而逐步增强，100 ng/ml当归多糖则对损伤气道上皮细胞的修复有显著抑制作用。不干预组、50 ng/ml干预组、EGF干预组图片见图1。
2.2 损伤气道上皮细胞上清液EGF含量 本研究选择 0 ng/ml，10 ng/ml，25 ng/ml，50 ng/ml当归多糖干预细胞上清液(干预24 h后)，ELISA试剂盒检测其EGF的含量，阴性对照组及各浓度当归多糖干预后细胞上清液EGF的含量(pg/ml)分别为：5.17±1.23，9.29±0.82，18.25±2.51，32.34±6.40;25 ng/ml，50 ng/ml当归多糖干预组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但是10 ng/ml当归多糖干预组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P=0.189)。该结果表明当归多糖可显著促进气道上皮细胞EGF的合成(表1)。
2.3 损伤气道上皮细胞上清液EGF含量与细胞损伤面积的相关性 采用Spearma相关分析，在不同浓度的当归多糖干预后，损伤气道上皮细胞上清液EGF含量与细胞损伤面积显著负相关(相关系数γ=-0.994，P<0.05)，由于既往研究显示EGF可明显促进气道上皮细胞的修复，所以本研究结果表明当归多糖对损伤气道上皮细胞的促修复作用可能通过其促进气道上皮细胞EGF的合成有关。表1 不同浓度当归多糖干预损伤气道上皮细胞的上清液的EGF含量
3 讨论
人体气道直接遭受众多环境因素(如细菌、病毒、可吸入颗粒、烟雾等)的直接侵袭，所以气道上皮细胞极其容易受到损伤。在正常人体中，由于其气道修复能力完善，所以不会导致发病，然而，在具有哮喘、COPD易感因素的人群中，在其气道上皮受损后，不能由新生的上皮细胞及时修复，而是发生延迟修复，最终导致气道重构的形成。所以寻找有效促进气道修复的药物尤为重要。
当归多糖的主要成分葡萄糖、阿拉伯糖、少量糖醛，既往研究主要集中在当归多糖的免疫调节及抗肿瘤作用[6]，但对于当归多糖是否可以促进气道上皮细胞损伤后的修复目前尚未见报道。本研究建立气道上皮细胞划痕损伤模型，证实了当归多糖可明显促进气道上皮细胞损伤后的修复，且可显著上调气道上皮细胞EGF的合成。Ye 等[4]的研究显示当归多糖可促进胃上皮细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达的上调，减少胃上皮细胞的凋亡，并采用EGFR中和性抗体证实EGFR介导了当归多糖对胃上皮细胞损伤后修复的促进作用，结合本研究，我们推测当归多糖对损伤气道上皮细胞的促修复作用可能通过其促进气道上皮细胞EGF的合成有关。但是否EGF直接介导了当归多糖的促气道上皮修复作用尚需进一步的研究。Wong等[3]的研究提示当归多糖可通过减少过氧化损伤保护肠道黏膜，既往研究表明过氧化损伤是导致气道上皮细胞凋亡的重要原因之一[7]，所以当归多糖是否也可以通过减少气道上皮细胞内源性过氧化物的生成，从而抑制气道上皮细胞的凋亡，然后促进气道上皮细胞损伤后的修复尚需进一步探讨。此外，本研究虽体外证实了当归多糖对气道上皮细胞损伤的促修复作用，但对于其是否可通过该作用而发挥对哮喘、COPD的治疗作用，需要体内研究予以证实。
本研究发现当归多糖可促进气道上皮细胞损伤后的修复，并提示当归多糖对损伤气道上皮细胞的促修复作用可能通过其促进气道上皮细胞EGF的合成有关。本研究为当归多糖应用于治疗哮喘、COPD等慢性气道疾病的气道损伤提供了理论依据。
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