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    《血液病学》

    HLAB无效等位基因B*5408N的核苷酸序列分析

    发表时间：2012-04-10  浏览次数：550次

    　　作者：吕沁风，朱发明，章伟，何俊俊，王炜，韩浙东，严力行 作者单位：浙江省血液中心，卫生部血液安全研究重点实验室，杭州 310006

    　　【摘要】 本研究探讨HLA 新的等位基因HLAB*5408N的分子基础。采用商用抽提试剂盒抽提样本DNA，利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLAB基因的第2-4外显子，对PCR扩增产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果表明：先证者样本测序得到两个等位基因，其中一个等位基因为HLAB*1527，另一个经blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank(DQ295998, DQ295999, DQ296000)。与最接近的HLAB*5401等位基因序列相比，新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同，即第553位G→T，这导致第161位氨基酸Glu(GAG)→终止密码(TAG)，蛋白质的翻译提前终止。血清学方法未能检出HLAB54抗原。结论：该等位基因为HLAB无效表达等位基因，已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLAB*5408N。

    　　【关键词】 等位基因

    　　Abstract The study was purposed to investigate the molecular genetic basis for HLA novel allele HLAB*5408N in Chinese population. DNA was extracted from whole blood by commercial DNA extraction kit, the HLAB exons 2-4 of the proband was amplified by allele specific primers PCR and the amplified product was sequenced for exons 2,3 and 4 bidirectionally. The sequencing results showed HLAB alleles of the proband as B*1527 and the novel allele. The sequences of the novel allele have been submitted to Genbank(DQ295998, DQ295999, DQ296000). After blast analysis, the novel allele showed a single nucleotide mismatch with HLAB*5401 in exon 3 at position 553 G→T, which resulted in an amino acid changing from Glu to premature stop codon at position 161. No the HLAB54 antigen specificity expression in the proband cells was found using HLAAB serological Typing Trays. It is concluded that this allele is a novel null allele and has been officially named B*5408N by the WHO Nomenclature Committee.

    　　Key words HLAB;allele; sequencing

    　　我们在造血干细胞捐献者样本中发现1例新的无效等位基因，被世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会正式命名为HLAB*5408N。HLA系统具有高度遗传多态性，存在少量不表达抗原的等位基因(无效等位基因)，它们在个体中存在有相应的基因序列，但其细胞上缺乏相应的抗原表达，这类等位基因的生物学作用仍需进一步研究[1-3]。现将HLAB*5408N核苷酸序列分析结果报告如下。

    　　材料和方法

    　　样本来源

    　　先证者为女性，浙江籍汉族，为造血干细胞捐献者，在本实验室HLA常规分型中因HLAB位点出现罕见的反应格局而进一步确认。

    　　样本DNA提取

    　　采用PELFREEZ DNA抽提试剂盒(Dynal Biotech, Wisconsin,USA)，严格按试剂说明书进行操作。

    　　HLA分型

    　　HLAA、 B、 DRB1基因分型采用PCRSSO方法(tepnel lifecodes,stamford, CT)，严格按试剂说明书进行操作，结果采用自动软件判读。HLAA、B血清学分型采用美国GTI试剂盒进行操作。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)HLA-B无效等位基因B*5408N的核苷酸序列分析

    　　HLAA基因2-4外显子测序分析

    　　PCR扩增 引物参照Dormoy等[4]的报道，由上海申能博彩公司合成(表1)。扩增反应体系总体积为100 μl，其中含10×PCR缓冲液10 μl，样本DNA 200-400 ng， TaqDNA聚合酶4.0 U;dNTP、MgCl2终浓度分别为 0.2 mmol/L、1.25 mmol/L，引物终浓度为 0.3 μmol/L。用ABI公司的9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为96℃预变性1分钟，96℃ 25秒，64℃ 45秒，72℃ 2分钟，共 22个循环;96℃ 25秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共13个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。

    　　序列分析 PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳25分钟，紫外透射仪下显示扩增成功后，从凝胶上切取目的DNA片段，用QIAquick Gel Extraction Kit(德国Qiagen公司产品)试剂盒纯化回收DNA片段。将回收纯化的扩增片段按Big Dye Sequencing Kit(ABI公司产品)试剂盒操作进行测序反应，测序引物见表1。采用乙醇/醋酸钠法纯化测序PCR产物。纯化产物经热变性速冷上ABI PRISM 377测序仪进行PAGE电泳，Sequence Analysis和MT Navigator软件进行数据分析。

    　　结 果

    　　PCRSSO基因分型

    　　先证者HLAA和HLADRB1可清楚指定为HLAA*24XX,; DRB1*04XX, 14XX。HLAB分型中探针出现罕见反应格局，在假设445探针为阴性时,可指定为HLAB*1527, *54XX，但重复实验445探针仍呈阳性。

    　　先证者HLAA基因24外显子序列分析

    　　采用HLAB*15和HLAB*54特异性等位基因引物分别进行PCR扩增，PCR产物直接测序分析后发现，其中一个等位基因为B*1527，另一个经blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank(DQ295998, DQ295999, DQ296000)。与最接近的B*5401等位基因序列相比，新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同，即第553位G→T(表2，附图)，结果导致第161位氨基酸Glu(GAG)→终止密码(TAG)。该等位基因为新的HLAB等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLAB*5408N。

    　　血清学分型结果

    　　先证者样本血清板反应格局为2A,2B,8D,8E,8F,12C,12A孔阳性，参照判断表格其血清学特异性可清楚指定为HLAA24，;HLAB62,。HLAB54多克隆抗体反应孔位置为9F,10F,这两孔反应均为阴性。

    　　讨 论

    　　HLA复合物位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA复合体包括多个基因座位，每一个座位上有多个等位基因，目前仍不断发现新的等位基因[3，5-7]。HLA基因可分为3类：HLAⅠ、Ⅱ、Ⅲ类基因，每一类基因均含有多个座位。HLA系统存在异常表达的等位基因(http://www. ebi.ac.uk/imgt/hla )，人群中存在的频率为0.003%-0.07%[1-3，8]，它们的命名常在数字名称后加上后缀来表示，现共有6种不同的后缀N、L、S、C、A、Q，其中“N”表示不表达或称为无效表达(null);“L”表示低表达量的等位基因;“S”表示等位基因编码的蛋白以可溶性分泌方式表达，但细胞表面不表达;“C”表示等位基因编码产物存在细胞浆中，但细胞表面不表达;“A”表示异常表达，其编码蛋白质是否表达有疑义;“Q”表示等位基因突变点位于已被证实能影响蛋白正常表达的区域。现发现的HLA异常表达等位基因为80个，其中HLAA为36个，HLAB为25个，HLAC为6个，HLADRB为7个，其它HLA位点为6个。其形成的分子机制主要为碱基插入、缺失、启动子区域突变、外显子点突变、内含子拼接位点突变等[4]。已经证实HLAⅠ类基因的第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，其中α1、α2两个结构域位于HLAⅠ类分子的顶部，共同组成抗原肽结合区，是分子的可变区和抗原性多肽识别的部位。本例HLAB*5408N无效等位基因的外显子3发生点突变，提前形成终止密码，在氨基酸第161位处合成链被终止，因此突变后α2结构域中氨基酸链长度为71个，只有野生型的77.2%，其抗原肽结合区发生明显的改变，这可能是其抗原特异性不表达的原因。

    　　HLA分型技术已广泛应用于多个领域，如HLA多态性的研究、HLA的生物学功能、器官和造血干细胞移植前供受者组织相容性配型、HLA与某些疾病的关联以及遗传学等方面，其分型技术主要有血清学和基因分型。血清学分型检测的是细胞表面HLA 抗原,其分型结果表示为HLA 抗原特异性。基因分型直接检测基因的序列,得到的结果代表HLA基因型。基因型别和抗原特异性存在一定的关系，但是也有区别。由于HLA存在异常表达的等位基因[1-3]，因此在实际分型工作和移植供者选择中应注意这两种分型方法的不一致，以避免分型结果的错误，遗漏异常表达的等位基因。

    　　【参考文献】

    　　1Smith DM, Baker JE, Gardner WB, et al. HLA class I null alleles and new alleles affect unrelated bone marrow donor searches. Tissue Antigens, 2005; 66:93-98

    　　2Bera O, Dubois V, Assaqa A, et al. A deletion in exon 3 results in a new HLAA*01 null allele (A*0115N) in a Martinican woman. Tissue Antigens, 2006; 67:61-63

    　　3Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2004. Tissue Antigens, 2005;65: 301-369

    　　4Dormoy A, Froelich N, Leisenbach R, et al. Monoallelic amplification of exons 2–4 using allele group specific primers for sequencebased typing (SBT) of the HLAA, B and C genes: preparation and validation of readytouse preSBT minikits. Tissue Antigens, 2003; 62:201-216

    　　5Yan LX, Zhu FM, Lv QF, et al. Identification of HLAB*5136 in the Chinese population. Tissue Antigens, 2005; 65:280-282

    　　6Yan LX, Zhu FM, Lv QF, et al. Identification of a new HLADRB1 allele, HLADRB1*1212 and confirmation of HLAB*1586. Tissue Antigens, 2005; 65:582-583

    　　7吕沁风,章伟, 何吉等.一例HLAA新等位基因A*3308的测序分析. 中华医学遗传学杂志,2006;23：269-271

    　　8Kotsch K, Wehling J, Blasczyk R. Sequencing of HLA Class II genes based on the conserved diversity of the noncoding regions: sequencing based typing HLADRB genes. Tissue Antigens,1999; 53:486-497