雄激素致不孕大鼠卵巢中卵泡抑素基因表达的研究
发表时间：2009-10-23 浏览次数：790次
作者：郭涓 作者单位：厦门大学附属中山医院（福建）
【摘要】 目的 本研究通过建立9d-ASR大鼠模型，比较ASR与正常组大鼠卵巢形态差别，两组间体重、空腹血糖及胰岛素，血清总睾酮，两组间卵巢中FSmRNA相对量，探讨FS与ASR大鼠病理生理的关系。方法 9日龄雌性SD大鼠30只，随机分为两组，一组颈背部皮下注射丙酸睾酮1.25mg，另一组同法注射等量中性茶油。100日龄测定体重、空腹血糖及胰岛素、血清总睾酮。一侧卵巢进行形态学比较，另一侧应用半定量RT-PCR方法，以β-actin为内参照，比较FSmRNA相对量。结果 ASR卵巢呈多囊性改变，颗粒细胞层次减少，卵细胞消失，体重、空腹血糖、胰岛素及血清睾酮明显升高。ASR卵巢中卵泡抑素表达增高，且卵泡抑素基因表达增加与血清睾酮呈正相关。结论 FSmRNA在ASR大鼠中的高表达与ASR大鼠的病理生理密切相关。
【关键词】 卵泡抑素 激活素 雄激素 大鼠 基因表达
1961年Barraclough发现给新生雌性大鼠注射雄激素可导致其成年后不孕，这种雄激素致不孕大鼠(androgen-sterlized rats，ASR)卵巢呈多囊性，体内雄激素增高，不排卵［1］。俞瑾教授在1993年首次在国内建立ASR大鼠模型并对其进行了一系列的研究，表明ASR大鼠可作为高雄激素和高胰岛素性无排卵动物的模型［2］。但ASR大鼠不排卵的机理以及对其病理生理的研究还有待进一步深入。本研究就近年来发现的卵巢内分泌的一种生殖因子：卵泡抑素(FS)在ASR大鼠病理生理中是否起一定的作用进行初步的探索，以从另一方面阐明其不排卵的机理。
1 材料与方法
1.1 建立9d-ASR大鼠模型
按照俞瑾实验方法：取第9日龄的雌性SD大鼠30只，随机分为两组，每组各为15只。一组颈背部皮下注射丙酸睾酮1.25mg，另一组同法注射等量中性茶油。第22日龄断奶。同等条件饲养。12小时光照与12小时黑暗交替，不加维生素类制品。第70日龄开始连续阴道刮片10天，无周期性，持续为角化细胞的为9d-ASR试验组。
1.2 体重、空腹血糖及胰岛素、血清总睾酮的测定
两组大鼠在第99日龄晚八时后禁喂饲。ASR组于第100日龄上午九时，正常对照组于第100日龄左右的动情期，分别称重记录。再用1.5％戊巴比妥纳以0.2ml/100g麻醉，抽取下腔静脉血。血糖测定由本院生化室完成，125I-胰岛素放射免疫分析药盒购自中国原子能科学研究所，血清睾酮放射免疫试剂盒购自中美合资天津九鼎医学生物工程公司。
1.3 卵巢形态学观察
两组大鼠取血后处死，取出一侧卵巢，置于10％福尔马林液固定，HE染色，石蜡切片，光镜检查。
1.4 卵巢总RNA提取及半定量RT-PCR 另一侧卵巢取出后，立即提取总RNA。卵巢总RNA提取方法以酸性硫氰酸胍-酚-氯仿方法进行（TRIzol试剂购自Life Technologies，Inc.）［3］。cDNA合成的反转录试剂盒购自Promega公司。PCR扩增在2400型PCR扩增仪（PE公司）上进行。94℃30秒、65℃40秒、72℃30秒，共35个循环。反应产物取6μl行2％琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色。经凝胶图像分析仪（Gel Doc 1000型，Bio-Rad）分析，通过计算FS与β-actin扩增带荧光强度的比值，得出FSmRNA相对量，用F表示。
PCR扩增以β-actin为内参照物。表1 卵泡抑素RT-PCR扩增的引物序列（略）
1.5 数据处理
应用SSCP9.0统计软件，t检验分析。
2 结果
2.1 卵巢形态学观察
1)卵巢大体检查：正常对照组中卵巢色泽鲜红，表面见多个黄体组织，ASR组卵巢体积较正常对照组减小，色泽苍白，表面见多个卵泡，未见黄体组织。2）卵巢光镜检查：正常对照组卵巢镜下可见多个黄体组织及各期卵泡。较大卵泡内颗粒细胞层次较多，多的可达十余层，未见囊性卵泡。ASR组卵巢在镜下见卵泡囊性扩张，颗粒细胞层次减少，甚至只剩1至2层，细胞排列松散，卵细胞消失，未见黄体组织。
2.2 大鼠体重、血清空腹血糖、空腹胰岛素、血清总睾酮、FSmRNA相对量的比较测定。
2.3 RT-PCR检测正常对照组与ASR组卵巢中FSmRNA的表达的比较见图1。表2 大鼠体重、血液空腹血糖、空腹胰岛素、血清总睾酮水平及FSmRNA相对量比较（略）注：与正常对照组相比P<0.05,F＝FS与β-actin扩增带荧光强度比值即FSmRNA相对量。
3 讨论
卵泡抑素是一种新发现的生殖调节因子。它是1987年Roberts和Ueno从牛和猪的卵泡液中分离出来的。它是一种含半胱氨酸的单链糖基化多肽，具有高度的结合力，在体内或体外都能结合激活素并中和激活素的活性。它的主要生理作用就是中和激活素的作用。卵泡抑素和激活素都是组织局部调节因子，它们在卵巢水平上，对卵泡的分化发育、黄素化、闭锁、黄体形成及卵巢激素的合成上都起一定的作用［4-9］。 本研究证实在正常对照组及ASR大鼠卵巢中FSmRNA均有表达，而且ASR组大鼠卵巢中FSmRNA表达较正常对照组明显升高。
在我们的试验中，观察到ASR大鼠卵巢中颗粒细胞层次明显减少，细胞排列松散。我们已清楚，在卵泡的发育分化中，颗粒细胞是由FSH促进增殖的。激活素作为颗粒细胞的有丝分裂原，能通过自分泌作用使颗粒细胞增殖，与FSH有协同作用。而FS能中和激活素的活性。结合俞瑾教授报道的ASR还存在FSH明显较低。我们推测，ASR大鼠可能是由于FSH量的减少及FS量的增多两方面的影响使得颗粒细胞正常的有丝分裂减少，颗粒细胞层次减少，细胞排列松散。
我们认为ASR大鼠雄激素的增多还可能通过以下的途径来实现。卵泡抑素水平的增高，中和了激活素的部分活性，削弱了激活素对卵泡膜细胞的旁分泌作用。此外，卵泡抑素的高表达，同样可能通过其结合特性，使得激活素对LH诱导的雄激素的产生的抑制作用减弱，雄激素产生增多。此外，卵泡抑素的高表达，同样可能通过结合特性，使得激活素对FSH诱导的芳香化酶的活性增强作用削弱，使得芳香化酶活性下降，雌激素生成减少，雄激素蓄积增加。另外，激活素还可以防止窦状卵泡后期的卵泡的过早黄素化。在体外试验中，对部分分化的颗粒细胞，它刺激了基础的P的产生、抑制了FSH诱导的P的产生。对完全分化的颗粒细胞则抑制了基础及FSH诱导的P的产生。而且在体外试验中，重组激活素以时间及剂量依赖的方式抑制LH诱导的P的产生及“黄素化抑制因子”催产素的产生。我们进一步推测：FS量的增加可中和激活素的部分生理作用，使得卵泡过早黄素化，卵泡发育停滞，不排卵。由于本研究是在转录水平证实了FS量的增加。但最终蛋白的表达是否也增加，还涉及到翻译的过程，仍需进一步的研究证实。
综上所述，基于以往的研究结果，本试验证实的ASR大鼠卵巢中卵泡抑素表达的增高很可能是通过过度中和激活素的生理作用，通过不同的途径使ASR的颗粒细胞层减少，雄激素增加，卵泡过度黄素化，发育停滞，与ASR的病理生理密切相关。
【参考文献】 ［1］Barraclough CA.Production of anovulatory，sterile rats by single injection of testosterone propionate［J］.Endocrinology，1961，68：62-67
［2］俞瑾，杨淑萍，张月萍，等.雄激素致高胰岛素与高雄激素性无排卵大鼠模型［J］.生殖医学杂志，1993，2（4）：215-219
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