镉对大鼠睾丸生精功能与性激素含量影响

镉对大鼠睾丸生精功能与性激素含量影响作者：李煌元，闫平，夏品苍，吴思英，李宏，何庆峰，张文昌    作者单位：福建医科大学公共卫生学院职业与环境卫生学系，福州 350004    【摘要】  目的 观察镉对大鼠睾丸生精功能与性激素含量的影响，为镉的精子毒性机制研究提供依据。方法 40只SD雄性大鼠分为对照组、低、中和高剂量染镉组，各组大鼠分别以镉0，0.25，0.5，1.0?mg/(kg·bw)连续腹腔注射染毒7?d，测定大鼠睾丸脏器系数、每日精子生成量、附睾尾精子数；用放射免疫法测定血清与睾丸组织中的睾酮和雌激素的含量。结果 中、高剂量组大鼠的左、右侧睾丸重量和睾丸脏器系数均低于对照组,差异有统计学意义。低、中和高剂量组附睾尾精子计数［(538±151)×106个，(242±143)106个，(39±4)×106个］均剂量依赖性方式低于对照组［(727±242)×106个］，差异均有统计学意义。中和高剂量组每日精子生成量［(6.2±4.8)×106个/g，(4.0±3.0)×106个/g］也均低于对照组［(12.7±6.4)×106个／g］，差异有统计学意义。中剂量组大鼠血清睾酮含量［(0.8±1.1)ng/ml］和睾丸组织中睾酮含量［(11.6±3.5)ng/ml］均低于对照组［血清(3.2±2.7)ng／ml，组织(20.9±3.8)ng／ml］，差异有统计学意义。所有染毒剂量组血清和睾丸组织中雌激素含量与对照组比较，差异均无统计学意义。结论 镉对睾丸产生明显的毒性，造成精子数量明显下降，睾酮水平下降是镉减弱睾丸生精功能的主要机制之一；镉未对雄性大鼠的雌激素生成产生影响，雌激素含量可能与镉削弱大鼠生精功能无关。    【关键词】  镉；精子生成；雌激素：环境内分泌干扰物　　Effect of cadmium on sperm production and level of sexual hormone in rat testis LI Huangyuan,YAN Ping,XIA Pincang,et al.Department of Occupational and Environmental Health,School of Public Health,Fujian Medical University (Fuzhou 350004,China)    Abstract： Objective  To investigate the effect of cadmium (Cd) on sperm production and level of sexual hormone in rat testis in order to provide the scientific support for the study on mechanism of sperm toxicity cadmium.Methods  Forty male SD rats were assigned randomly to four groups and were administrated with various doses of cadmium chloride ［daily dose was respectively 0,0.25,0.5,1.0?mg Cd2+/(kg·bw)］ for 7 days in intraperitoneal injection,then the testis weight,ratio of testis to body,caudal epididymides testicular sperm count and daily sperm production were measured.The level of testosterone or estrogen in both serum and testis tissue were measured by radioimmunoassay. Results  The weight of leftward,dextral testis and ratio of testis to body in the middle and high dose group were significantly lower than those of the control group.The caudal epididymides testicular sperm count of the low,middle and high dose group ［(538±151)×106,(242±143)×106,(39±4)×106］ were significantly lower than those of the control group in dosedependent manner ［(727±242)×106］,The daily sperm production of the middle and high dose group ［(6.2±4.8)×106/g,(4.0±3.0)×106/g］ were significantly lower than those of the control group ［(12.7±6.4)×106/g］.The testosterone level of both serum ［(0.8±1.1) ng/ml］and testis tissue ［(11.6±3.5) ng/ml］in the middle dose group were significantly lower than those of the control group ［serum:(3.2±2.7)?ng/ml,tissue:(20.9±3.8)ng/ml］.There was no difference in estrogen level of both serum and testis tissue in each group.Conclusion  Cadmium causes obvious toxicity in testis and markedly decrease sperm amount.Decreased testosterone level is one of mechanisms underlying sperm production function impaired by cadmium.Estrogen production in male rats is not impaired and estrogen level appears no linked with weaken function of sperm production caused by cadmium.    Key words： cadmium;sperm production;estrogen;environmental endocrine disruptors (EEDs)　　近年来，环境内分泌干扰物对生殖系统的影响问题深受人们广泛关注，其中对生精功能的影响是目前生殖毒理学研究的重点之一〔1〕。镉(Cadmium，Cd)是一种重要的环境和工业毒物，也是一种蓄积时间长、存在范围广的环境污染因素的多器官、多系统毒物。最近研究表明，镉是一种高度可疑的环境内分泌干扰物质〔2〕。镉对大鼠睾丸生精功能影响的机制不明，尤其是镉对睾丸组织雌激素(E2)的影响报道较少。生物医学研究发现，雌激素对于精子发生、成熟和维持雄性的交配行为和生育力也是必需的〔1〕。本研究通过染镉对大鼠睾丸的性激素产生和睾丸生精功能的影响，探讨镉对生精功能的毒性机制，为镉环境内分泌干扰作用的毒性评估提供科学依据。1  材料与方法　　1.1  主要试剂 　　氯化镉(CdCl2)(上海亭新制药厂)，分析纯(AR)。E2放免测定药盒(美国Diagnostic Systems Laboratories公司，Texas，USA)。T放免测定药盒(北京北方生物技术研究所)。　　1.2  实验方法　　1.2.1  动物染毒与处理 　　40只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重209～235?g(福建医科大学实验动物中心)。大鼠按体重随机分为对照组、低、中和高剂量染镉染组。(每组10只)，染毒剂量分别为0，0.25，0.5，1.0?mg/(kg.bw)(以Cd2+计)，对照组注射生理盐水。每天以1?ml药液/(kg·bw)等容量腹腔注射，每天1次，连续染毒7?d后断头处死动物，采血制备血清，样品冷藏于-20℃冰箱中备用测定E2和T的含量。同时解剖分离附睾、睾丸称取脏器湿重。　　1.2.2  每日精子生成量的测定 　　用Robb等的方法〔2〕测定睾丸每日精子生成量，取右侧睾丸，称重，去除睾丸白膜后，睾丸实质组织在10?ml匀浆液(0.5?mol/L氧化钠-0.05% Triton X-100-0.25％硫柳汞混合液)中用电动玻璃匀浆机破碎匀浆。用血球计数板计数匀浆液呈长椭圆形的精细胞核的数目，计算每克睾丸组织的每日精子生成量(DSP)。　　1.2.3  附睾尾精子计数　　取右侧附睾尾，称重后充分剪碎，用生理盐水定容至50?ml，再稀释10倍后，用血球计数板法计数4大格精子数，除稀释倍数后计算每克附睾尾组织的精子数。　　1.2.4  睾丸组织制备 　　取一定重量的睾丸，去被膜，称重，剪碎睾丸实质，以1∶4?g/ml比例加入生理盐水，用玻璃匀浆器制成睾丸匀浆液，用低温高速离心机10?000r/min离心30?min，静置片刻，取上清液-30℃保存备用于组织中雌激素(E2)和睾酮(T)含量的测定。　　1.2.5  雌激素(E2)和睾酮(T)含量的测定 　　睾丸和血清中雌激素(E2)和睾酮(T)含量全部采用放射免疫法在放射免疫γ计数器(SN-682)成批测定，按照药盒操作规程进行操作。　　1.3  统计分析 　　采用SPSS 12.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和秩和检验(Kruskal-Wallis One-Way ANOVA)进行相应的分析。2  结  果　　2.1  镉对雄性大鼠体重的影响 　　在大鼠染镉第4和第7?d，高剂量组大鼠体重均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，表明高剂量镉抑制大鼠体重的增长。在大鼠染镉第7?d，低剂量组大鼠体重也低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。　　2.2  镉对雄性大鼠睾丸和睾丸尾的影响(表1) 表1  镉对大鼠睾丸和睾丸尾的影响(略)注：与对照组比较，a P<0.01，b P<0.05；与低剂量组比较，c P<0.01；与中剂量组比较，d P<0.05。　　由表1可见，中、高剂量组大鼠左、右侧睾丸重量和睾丸脏器系数均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，但中、高剂量组大鼠左、右侧睾丸尾重量与对照组比较差异无统计学意义，表明中、高剂量镉对睾丸有损害。　　2.3  镉对雄性大鼠睾丸精子生成的影响(表2)  表2  镉对雄性大鼠睾丸精子生成的影响(略)注：与对照组比较，a P<0.01，b P<0.05；与低剂量组比较，c P<0.01；与中剂量组比较，d P<0.01。　　由表2可见，低、中和高剂量组附睾尾精子计数均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，镉剂量与其抑制睾丸精子生成呈剂量效应关系。中和高剂量组每日精子生成量也均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明中、高剂量镉损害大鼠睾丸的生精功能。　　2.4  镉对雄性大鼠睾丸性激素生成的影响(表3) 表3  镉对雄性大鼠睾酮(T)和雌激素(E2)含量的影响(略)注：与对照组比较，a P<0.05。　　由表3可见，中剂量组大鼠血清和睾丸组织中睾酮含量均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05);但高剂量组剂量组大鼠睾酮含量组与对照组比较，差异无统计学意义。所有染毒剂量组血清和睾丸组织中雌激素含量与对照组比较，差异均无统计学意义，表明镉影响了睾丸睾酮的生成，但未见镉影响雌激素的生成。3  讨  论    近年来，环境内分泌干扰物对生殖系统的影响问题深受人们广泛关注。精子的数目和质量是反映雄(男)性生殖力的主要标志，它直接关系到妊娠和胚胎的质量。所以外源性化学物对精子发生的影响是目前生殖毒理学研究的重点之一〔1〕。本实验结果表明，0.25，0.5和1.0?mg/(kg·bw)镉对成年雄性SD大鼠进行腹腔染毒(连续7?d)，染毒大鼠精子计数和每日精子生成量均下降，证明镉可削弱大鼠的生精功能。徐莉春等〔4〕报道，0.8?mg/kg腹腔注射(连续7?d)染镉组大鼠睾丸精子计数和每日精子生成量均比对照组明显降低，而本实验低至0.25?mg/(kg·bw)的镉剂量也对大鼠睾丸精子头计数和每日精子生成量有影响。    本研究结果表明，镉染毒对睾丸重量和脏器系数有影响。动物实验表明，镉可引起睾丸组织的病理学改变甚至坏死，镉污染可导致血浆睾酮水平的降低〔5,6〕。而本研究中，中剂量组大鼠睾酮含量下降，但高剂量组睾酮含量与对照组比较差异无统计学意义，这可能是由于镉的染毒剂量增大造成下丘脑垂体睾丸轴的负反馈调节增加睾酮生成所致。除睾丸组织和细胞(如间质细胞等)出现病理改变外，低剂量染镉血清T水平下降的原因可能是镉干扰黄体生成激素(LH)与睾丸间质细胞LH受体之间的相互作用。    研究发现，睾丸和附睾中雌激素受体(ERα)的表达甚至比子宫中还要高〔7〕，而且雌激素对于精子发生、成熟和维持雄性的交配行为和生育力也是必需的〔1〕。我们的前期研究结果〔8,9〕表明，体外实验未见镉对〔3H〕-E2与子宫雌激素受体亲和力产生影响。故本研究利用超灵敏的雌激素放射免疫测定试剂盒检测雌激素含量，以便探讨镉是否会通过影响雌激素生成而影响生精功能。本研究未观察到镉对雄性大鼠雌激素含量的影响，推测镉对雄性大鼠生精功能的影响与雌激素含量无关。    综上所述，镉对睾丸产生明显的毒性，造成精子数量明显下降，睾酮水平下降是镉对睾丸生精功能影响的主要机制之一。本实验条件下，镉未对雄性大鼠的雌激素生成产生影响，雌激素含量可能与镉削弱大鼠生精功能无关。【参考文献】　　〔1〕夏世钧，吴中亮.分子毒理学基础［M］.武汉：武汉科技出版社，2001：188-205.　　〔2〕李煌元，吴思英，张文昌，等.镉的雌性性腺生殖毒性研究现状［J］.中国公共卫生，2002，18(3)：379-381.　　〔3〕Robb GW,Amann RP,Killian GJ.Daily sperm production and epididymal sperm reserves of pubertal and adult rats［J］.J Reprod Fert,1978,54(1): 103-107.　　〔4〕徐莉春，王沭沂，杨小芳，等.应用计算机辅助精子分析系统检测镉对大鼠精子运动能力的影响［M］.中华劳动卫生职业病杂志2000，18(4)：223-225.　　〔5〕King LM,Anderson MB,Sikka SC,et al.Murine strain differences and the effects of zinc on 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