人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建
发表时间：2012-05-07 浏览次数：619次
作者：周广举,梁自文,陈渝,王裴,张小容 作者单位：第三军医大学西南医院内分泌科，重庆 400038;第三军医大学西南医院烧伤研究所，重庆 400038
【摘要】目的 构建内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因启动子的报告基因重组质粒，为EOLA1启动子的分析鉴定奠定基础。方法 提取人内皮细胞基因组DNA，设计引物克隆EOLA1基因上游不同长度的基因片段，插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中，经限制性内切酶酶切鉴定、测序。结果 成功构建了3种含有不同长度EOLA1上游基因的pGL3-EOLA1-Luc荧光素表达质粒，形成了系列的EOLA1启动子重组体。结论 建立的不同长度EOLA1上游基因的报告基因系统为EOLA1启动子的活性分析奠定了基础。
【关键词】 内皮细胞高表达脂多糖相关因子1,启动子,荧光素酶报告基因
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30670838)
Abstract: Objective To constructe recombinant of luciferase promoter reporter gene of endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1(EOLA1),which would be used in the following research for promoter determination.Methods Genomic DNA of human endothelial cell was prepared,and specific primers were designed to clone different length of the upstream regions.These DNA fragments were inserted into the pGL3-Basic which was the vector of luciferase reporter gene.These recombinant reporter gene were digested with restriction enzyme and determined the sequence.Results Three expression plasmid of pGL3-EOLA1-Luc fluorescein with different length of upstream gene were constructed successfully,and the recombinant of promoter of EOLA1 were obtained.Conclusion The reporter gene system of EOLA1 upstream gene with different length offer the substructure for analysing the activity of EOLA1 promoter for further research.
Key words: endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1;promoter;luciferase reporter gene
内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)是本实验室在前期研究中从受内毒素刺激的血管内皮细胞中克隆的人类新基因(GeneBank NO.AY074889)[1-2],对其结构特性和功能的研究已经明确，EOLA1基因在人染色体上定位于Xq27.4位点，其表达产物主要通过在细胞内与金属硫蛋白2A(metallothionein 2A,MT2A)相互作用调控细胞增殖，参与炎症反应时细胞内保护机制[3]，但其基因调控方式尚不明确。为此，本研究拟克隆不同长度的EOLA1上游基因并构建荧光素酶报告基因载体，为研究其基因调控方式奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂
人脐静脉内皮细胞株ECV-304、大肠杆菌菌株DH5a由第三军医大学西南医院烧伤研究所实验室保存;DMEM培养基、精制胎牛血清为Hyclone公司产品;dNTPs、TaKaRa LA Taq为TaKaRa公司产品;限制性内切酶KpnI、Bgl II,pGEM-Teasy、T4DNA连接酶、pGL3- Basic载体为Promega公司产品;DNA回收试剂盒为博大泰克公司产品;胰蛋白胨、酵母菌提取粉、细菌琼脂粉、琼脂糖为Oxoid产品;质粒提取试剂盒为Omega公司产品;2×Pfu PCR Master Mix为TIANWEI公司产品;Lambda Bio-20紫外分光光度仪为Perkin-Elmer公司产品;SX-100凝胶成像分析系统为上海四星公司产品。
1.2 细胞培养及细胞基因组DNA的提取
人脐静脉内皮细胞株ECV-304培养于含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基中。按照细胞基因组DNA的提取试剂盒说明进行细胞基因组的提取。
1.3 引物设计
利用梁自文博士所获EOLA1基因cDNA序列[1,4]，用Primer软件包设计3个上游引物和3个下游引物：(1)片段-2375～-1299的上游引物：5′-CGGGGTACCGGATTGCTGGGGACAGATTTGT-GACTT-AG-3′，下游引物：5′-GGAAGATCTGTAAGGCTGGCGGGTGAGAATGGTG-3′;(2)片段-2375～+51的上游引物：5′-CGGGGTACCGGATTGCTGGGGACAGATTTGTGACTT-AG-3′，下游引物：5′-GGAA-GATCTCTCCGGGAAACCAGTGGCCAGTGAC-3′;(3)片段-1672～+51的上游引物：5′-GGGGTACCCAGTTCGGCTCTGCTTCATTT-3′;下游引物：5′-GGAAGAT-CTCTCCGGGAAACCAGTGGC-3′。由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.4 pGL3-Basic载体的酶切产物及回收
用KpnI和Bgl II内切酶将pGL3-Basic载体进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒回收纯化分子量大的酶切产物。
1.5 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增
采用PCR法，以ECV-304细胞基因组DNA为模板，用超高保真DNA聚合酶Pfu PCR Master Mix扩增得到EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段。为了方便克隆，在各上游引物的5′端引入KpnI酶切位点，在下游引物5′端引入Bgl II酶切位点。首先用相应的上下游引物扩增-2375～-1299片段，条件如下：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行胶回收后，然后进行加A反应后再与载体pGEMT连接，将连接后产物CaCl2法常规转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒。再将提取的质粒经KpnI、Bgl II双酶切后，用T4DNA连接酶连接插入pGL3-Basic载体，CaCl2法常规转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，构建得到pGL3-1075 bp(片段-2 375～-1 299长1 075 bp),并测序鉴定。以ECV-304细胞基因组DNA为模板，分别用相应引物扩增得到不同长度的启动子片段，PCR条件根据不同引物稍作调整。
1.6 重组体构建
上述PCR产物用试剂盒回收，KpnI、Bgl II酶切回收纯化，用T4DNA连接酶与pGL3-Basic连接，CaCl2法常规转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，构建得到不同长度片段启动子-荧光素酶载体pGL3-1075 bp、pGL3-1723 bp、pGL3-2426 bp构成一系列启动子重组体。
1.7 重组体鉴定
以上得到的荧光素酶载体pGL3-1075 bp、pGL3-1723 bp、pGL3-2426 bp用KpnI、Bgl II酶切鉴定并经DNA基因测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)分析证实。用Omega质粒提取试剂盒制备纯化DNA。利用Lambda Bio-20紫外分光光度仪检测纯度和定量。
2 结果
2.1 PCR产物及重组体的酶切鉴定
利用SX-100凝胶成像分析系统，EOLA1基因5′侧翼区3个不同长度片段为1 075 bp PCR产物、1 723 bp PCR产物、2 426 bp PCR产物;启动子-荧光素酶载体pGL3-2426 bp、pGL3-1723 bp、pGL3-1075 bp一系列启动子重组体进行KpnI、Bgl II双酶切后见到预期条带。见图1。
2.2 测序结果
经测序证实克隆基因片段插入方向正确。插入的接头处核苷酸序列正常，未发现碱基突变。
3 讨论
EOLA1在静息内皮细胞中表达较少，受脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后，表达显著上调，显示其与内皮细胞活化和正常功能维持密切相关。在临床上，LPS刺激常导致系统性炎症反应，血管内皮的活化和功能障碍在其中起了关键作用[5]。内皮细胞受到炎症刺激时，刺激信号传入胞内，经胞内信号分子转导到核内，调控相关基因表达的改变，主要是促进致炎因子的大量释放，诱发和加重炎症反应，而炎症反应又促使内皮细胞凋亡和功能障碍。近年来发现炎症反应同时促进了细胞内抗炎介质的释放和细胞增殖，从而抵抗炎症反应的破坏作用,称为细胞内保护性反应。EOLA1可能通过上调表达后促进内皮细胞增殖来参加了炎症反应时细胞的自我保护作用，详细机制尚须深入研究[6]。因此，有必要对EOLA1基因的表达调控进行深入研究。基因的表达调控可以在不同水平及多阶段进行，但在转录水平调控基因表达是最经济和有效的。
目前基因报告系统广泛应用于研究真核细胞基因的表达和调控。利用报告系统研究EOLA1启动子的调控作用可以最大限度避免下游基因表达产物对启动子的反馈干扰，能真实反映外周因素对调控序列的影响。荧光素酶报告系统是广泛应用于哺乳动物的第1个非同位素遗传报告系统，与常用的CAT报告基因相比更加适合对基因瞬时表达的研究，从而使其成为研究可诱导系统一种理想的报告分子。基因外显子的5′侧翼区的3 000 bp左右的区段为基因的调控元件所在部位，常包含基因转录启动子、增强子、沉默子和转录因子结合位点[7]。作为EOLA1基因启动子调控研究的前期工作，本研究扩增了该基因5′端上游3个不同长度的DNA序列，并克隆到pGL3-Basic中，成功构建了EOLA1表达调控载体，为体外研究EOLA1启动子转录调节提供了新的手段。目前，EOLA1基因启动子的结构和功能研究尚处于起始阶段，上述工作将为进一步研究该基因启动子区重要的顺式调控元件和相关的反式作用因子以及核基因对于诱导信号的应答机制，发现调控该基因表达的重要靶标奠定基础。
【参考文献】
[1]Liang ZW,Luo XD,Yang ZC.Cloning of differentially expressed genes following lipopolysaccharide stimulation in human umbilical vein endothelial cells[J].Chin J Traumatol,2003,6(2):107-113.
[2]梁自文，杨宗城，罗向东，等.人类内皮活化相关新基因EOLA1的发现与初步研究[J].解放军医学杂志，2003，28(5)：422-424.
[3]Liang Z,Yang Z.Identification and characterization of a novel gene EOLA1 stimulating ECV304 cell proliferation[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325(3):798-802.
[4]梁自文，杨宗城，罗向东.人类新基因EOLA1全长cDNA序列的克隆[J].第三军医大学学报，2002，24(3)：封2.
[5]Chen J,Liu B,Liu Y,et al.A novel gene IC53 stimulates ECV304 cell proliferation and is upregulated in failing heart[J].Biochem Biophy Res Commun,2002,294(1):161-166.
[6]梁自文，杨宗城，刘月明,等.刺激ECV304细胞增殖的新基因EOLA1的克隆和功能研究[J].中华医学遗传学杂志，2005，22(5)：518-523.
[7]梁自文，杨宗城，陈 建，等.EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究[J].第三军医大学学报，2006，28(10)：1001-1003.
