犬牙周膜牵张快速移动牙压力侧牙周组织中RANKL和OPG表达的研究

　　正畸牙齿受力后，牙周组织改建包括张力侧骨形成和压力侧骨吸收，二者的不断调整，使牙周组织达到一个新的平衡。“牙周膜牵张成骨”快速移动牙齿的关键是压力侧牙槽隔减阻Lll，有关其压力侧牙周组织的改建过程如何?　　本实验通过建立牙槽隔减阻牙周膜牵张(periodontal ligament distraction, PDLD)快速正畸牙齿移动的Beagl。犬实验动物模型。观察PDLD快速牙齿移动过程中，压力侧牙周组织中核因子KB受体活化因子配体(receptor activator  of  NF-KBligand, RANI}I)和护骨素(osteoprogerin, OPG)的表达J清况。RANKL和OPG是调节破骨细分化、吸收功能和凋亡的重要因子研究PDLD快速牙齿移动牙周组织改建的机制和临床运用提供理论依据。　　材料与方法　　1.实验动物:.8只纯种雄性Beagle犬，12至18月龄，体重10-13kg.    2.主要试剂:RANIL,OPG抗体(美国Bioworld公司)，TRAP染色试剂盒(美国Sigma公司)，兔SP检测试剂盒(北京中杉金桥)，浓缩型胰酶消化液(北京中杉金桥)，浓缩型DAB试剂(北京中杉金桥)。　　3.实验方法:8只犬随机分为A组、B组、C组和D组。拔除每只犬下领两侧的第二前磨牙。采用自身对照设计，每只犬下领的左右侧随机分为PDLD侧和常规方法正畸牙齿移动对照侧。        PDLD狈(:对弟一前磨才远中才槽同隔伯一诚阻术，用釉凿沿第二前磨牙拔牙窝近中牙槽间隔与舌侧骨板交界处、与颊侧骨板交界处凿沟减阻，沟的深度到达第一前磨牙骨硬板(但不得穿通骨硬板，以免损伤其牙周膜)，同时在拔牙窝底斜向第一前磨牙根尖方向凿沟减阻，使拔牙窝近中的牙槽间隔半游离(图1)。于第一与第三前磨牙粘固牵张器3天后开始加力，频率为每天早晚两次，每次将螺旋旋转900，加力2周后固定保持(图2)。        常规方法对照侧:不行牙槽间隔减阻术，于第一与第三前磨牙牙颈部直接粘接NiTi螺旋弹簧，力值约1.47 N(测力计测定)，加力2周后，换结扎丝固定保持(图3)。检验。　　6.免疫组化染色(SP法):免疫组化染色步骤按产品说明书进行，RANKL,OPG抗体(稀释比例1:100)。在压力侧牙周组织中从牙槽峪顶到根尖随机各选择5个视野，应用Imag-pro-plus医学图象分析系统测量RANKL,OPG平均光密度值。采用SPSS 13.0统计软件，对RANKLOI'G相对含量和R.4NKL/OPG含量比值进行检验。　　结果　　1.牙齿移动距离的测量结果:第1周内，常规对照侧牙齿向远中平均移动0.47mm, PDLD侧为1.47mm。第2周内，常规对照侧平均移动0.21 mm ,PDLD侧为2.73mm。两侧牙齿移动距离存在统计学差异(P<0.01)(表1)。        2.HE染色结果:加力后，常规对照侧移动牙压力侧牙周膜明显缩窄，牙周纤维排列紊乱，牙周膜细胞减少，可见明显无细胞结构的玻璃样变组织(图你PDLD侧移动牙压力侧牙周膜缩窄较常规对照侧轻，未见玻璃样变组织，固有牙槽骨弯曲或折断，加力2周时，远中间隔骨已进人拔牙窝，间隔骨吸收变薄(图5)。加力2周，保持2周时，常规对照侧移动牙压力侧牙周膜中玻璃样变组织部分清除，牙槽间隔骨表面有明显破骨细胞及骨吸收陷窝;PDLD侧移动牙压力侧原有的固有牙槽骨消失，牙周膜借疏松的骨质与拔牙窝内的新生骨小梁相连，细胞成分明显增多。可见丰富的新生血管。加力2周，保持4周时，PDLD和常规移动牙压力侧牙周膜宽度基本恢复，细胞成分较正常牙周膜稍多，可见较多的血管，牙周膜纤维及骨硬板仍处在不断的改建中。　　3.破骨细胞TRAP染色结果:PDLD和常规方法对照侧移动牙压力侧牙周组织中TRAP染色阳性的破骨细胞在受力后明显增加。加力2周时，TRAP染色阳性的破骨细胞数在PDLD侧达峰值，而常规对照侧在加力2周，保持2周时达峰值。加力1周时}P <0.01}、加力2周时(P <0.01)、加力2周，保持2周时(P <0.05 )PDLD侧较常规方法对照侧移动牙压力侧牙周组织中破骨细胞个数高(表2).       4.RANKL, OPG在压力侧牙周组织中的表达:正常牙周组织中RANKL,OPG的表达呈弱阳性。RANKL,OPG均表达于牙周膜成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、骨衬里细胞和骨陷窝内破骨细胞的胞浆加力后，RANKL在压力侧牙周组织中阳性表达增强(图6,7)。加力2周时，PDLD移动牙压力侧牙周膜R:ANI<I的表达达峰值。加力2周，保持2周时，常规对照侧RANKL的表达达峰值。加力1周(P <0.01)、加力2周(P <0.01)、加力2周，保持2周( P <0.05)时RANKL的表达在PDLD侧均较常规方法对照侧高(表3).     加力后，OPG在压力侧牙周组织中阳性表达逐渐增强(图8,9)。加力1周(P<0.01)、加力2周(P<0.01、加力2周，保持2周(P <0.01)、加力2周，保持4周(P <0.01)时OPG在PDLD移动牙压力侧牙周膜的表达均较常规对照侧明显(表4)0        加力后，RANKL/OPG含量比值在压力侧牙周组织中逐渐升高，加力2周时，压力侧牙周膜RANKL/OPG含量比值在PDLD侧达峰值，而常规对照侧在加力2周，保持2周时达峰值。加力1周(P<0.01)、加力2周(P<0.01)、加力2周，保持2周(P <0.05)时压力侧牙周膜RANKL/OPG含量比值在PDLD侧均较常规对照侧高。加力2周，保持4周(P<0.01)时RANI}L/OPG含量比值在PDLD侧较常规对照侧低(表5)。    讨论　　本研究中，PDLD移动牙明显加快了牙齿移动的速度。主要原因是PDLD侧移动牙远中牙槽间隔减阻，牙齿移动时受到的阻力比常规对照侧小:HE染色显T : PDLD侧移动牙压力侧牙周膜受压缩窄的程度较常规对照侧轻，未出现明显的透明玻璃样变组织，并有间隔骨有受压折断现象，证实了PDLD侧牙移动阻力比常规对照侧小。        以往有关体内外牙周膜细胞受到压力后RANKL和oPG表达变化有如下三种观点:第一，RANKL的表达升高，OPG的表达变化不明显12]。第二，RANKL的表达升高，OPG的表达下降[3]。第三，RANKL和OPG的表达均升高}a}。本实验发现:加力期间，移动牙压力侧牙周组织中RAN KL表达增强，OPG的表达也增强，但是OPG的表达变化较RANKL弱。在停止加力后的保持期间，OPG的表达维持在较高的水平。有关牙周膜细胞受压后OPG表达变化的差异，可能与检测OPG的组织来源、检测方法、观察时间及其含量测定方法不同有关。本实验中，PDLD侧和常规对照侧移动牙压力侧牙周膜中RANKL和OPG的表达均增强，但是在PDLD侧的表达明显强于常规对照侧。其原因如下:第一，常规对照侧牙周膜受到的是NiTi螺旋弹簧持续性压力，而PDLD侧牙周膜受到的是每天早晚两次旋转螺旋打一大器90。产生的间歇性压力，由间歇性压力引起RANKL的表达要比持续压力更强m.从而诱导PDLD侧RANKL的高表达。第二，PDLD侧牙槽隔减阻手术及受力后移动牙远中牙槽间隔的压缩变形和微小骨折会引起局部的炎症反应，一些炎症介质(IL-1 a , IL-1(3 , IL-6 , PGEz, TNF-a , TNF-(3等)的释放，可以诱导RANKL,OPG表达增强f}-}l局部微环境中RANKL和OPG含量比值的大小是决定破骨细胞形成及功能活性的关键，从而决定是否发生骨吸收及骨吸收的程度U of。本实验中，在PDLD钡」，加力1周时，RANKL/OPG含量比值明显升高，TRAP阳性破骨细胞大量产生。加力2周时，RANKL/OPG含量比值达峰值，此时TRAP阳性破骨细胞数也达到了峰值。加力2周，保持2周时，R ANKL/OPG含量比值仍较高，可见骨吸收活动在PDLD侧一直都很活跃;在常规对照侧，RANK L/OPG含量比值随时间逐渐升高。到加力2周，保持2周时，RANKL/OPG含量比值达到峰值，TRAP阳性破骨细胞也达到峰值，此时骨吸收活动最为活跃。但是PDLD侧较常规对照侧RANKL/OPG含量比值升高幅度较大，峰值出现时间较早，持续时间较长，且与TRAP染色阳性破骨细胞数变化基本相一致。在PDLD侧，加力2周时，RANKL/OPG含量比值达峰值之后开始下降;而常规对照侧，加力2周，保持2周时，RANKI,/OPG含量比值达峰值之后开始下降。至加力2周，保持4周时，PDLD侧和常规对照侧的RANKL/OPG含量比值均低于正常对照值。可见:停止加力固定保持期，PDLD侧RANKL/OPG含量比值比常规对照侧下降的早并且快，为PDLD侧固有牙槽骨形成提供条件。在PDLD侧，虽然在加力期移动牙压力侧牙周组织中存在更为活跃的骨吸收活动，但是由于在固定保持期RANKL/OPG含量比值下降早、快，破骨活动受到抑制，骨改建由骨吸收为主转为骨形成占主导地位，固有牙槽骨的形成仍较迅速。