乙肝大三阳患者317例HBV DNA定量检测结果分析

　　作者：张润书 安会波 刘征燕 　　作者单位：石家庄市，河北省儿童医院病理科

　　【关键词】 PCR HBV DNA 定量 大三阳 拷贝/ml

　　聚合酶链反应(PCR)测定现已用于，如病毒性肝炎治疗的动态观察。本文通过对我科317例乙肝五项大三阳患者HBV DNA定量检测中3例病毒量<103拷贝/ml的样本进行纠正，分析PCR定量检测拷贝数明显偏低的原因，报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 选择我科2007年3月至2008年2月乙肝五项为大三阳的患者371例进行HBV DNA定量检测。

　　1.2 方法 检测使用SLAN荧光定量扩增仪，复星乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒。该试剂盒对HBV的检测灵敏度为103拷贝/ml, 检测范围为103～108拷贝/ml。由专业技术人员严格按操作规程进行检测。

　　1.3 判断HBV复制的标准 HbeAg阳性和HBV DNA拷贝定量检测病毒含量>105/ml[1]。这说明病毒复制能力强，有较高的传染性。

　　1.4 统计学分析 计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 317例HBV DNA定量检测结果 全部病例中，314例 (99.05%) HBV DNA定量检测病毒含量>105拷贝/ml,仅3例 (0.95%)HBV DNA定量检测病毒含量<103拷贝/ml，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 将HBV DNA定量检测病毒含量<103拷贝/ml的3例患者标本调整后再次检测结果 将此3例标本放置4 d后稀释10倍重新检测，2例再次检测病毒含量分别为3.74×106拷贝/ml和7.13×105拷贝/ml。而另1例再次检测结果同前，经分析考虑可能为病毒变异，更换科华公司的HBV DNA定量检测试剂盒后检测，其病毒含量为2.63×105拷贝/ml。

　　3 讨论

　　HBV DNA定量检测灵敏度高、特异性强，可反映病毒在体内活动能力，对指导临床治疗及判断预后具有重要意义。但由于PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素如扩增仪空间温度有差异、临床标本中Taq酶抑制剂的存在都会影响扩增产物的量，不能对原始模板准确定量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系。通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量[2]。因此，如何消除各种影响PCR准确定量的因素，成为PCR检测价值的关键。

　　影响PCR结果的因素很多，包括(1)标本采集和保存不当，使靶核酸降解;(2)标本处理不当，使靶核酸丢失;(3)试剂不合格、过期、保存运输不当;(4)核酸扩增仪温度不准确、扩增仪设置不符合要求;(5)水浴锅温度不准确，核酸提取失败;(6)移液器不准确，使扩增体系比例不合适;(7)扩增管或枪头存在抑制物导致扩增失败或不准确;(8)离心不够，未彻底清除抑制物;(9)抗病毒治疗，标本中含有抑制物;本组资料中病毒含量<103拷贝/ml的3例患者均长期接受抗病毒治疗，所以影响检测结果;(10)待扩增标本中的模板DNA浓度过高，超过试剂检测范围;(11)待扩增标本中的模板DNA发生变异。

　　如本组资料中有1例患者调整后(稀释10倍)再次检测病毒含量，结果同前，经分析考虑可能存在病毒变异，更换试剂盒后检测其病毒含量为2.63×105拷贝/ml。只要采取有效的预防措施，这些影响结果准确性的因素是可以被消除的。具体预防措施：(1)上岗人员岗前培训并取得资格证书;(2)设严格的质量控制;(3)严格按试剂生产厂家提供的试验程序操作;(4)使用卫生部或国家权威机构指定厂家生产的质量可靠的试剂，并在使用过程中注意试剂的有效期，过期的试剂切勿使用;(5)对病原体发生变异者，当扩增某一基因片段的引物不能取得结果时，改用扩增另一基因片段的试剂;(6)检查仪器的设置是否符合要求，如温度、时间、循环次数及器械刻度，对相关器械定时检测并校对;(7)做好标本的采集和保存工作，防止靶核酸降解;(8)抗毒药物对HBV DNA有抑制作用，放置数天后抑制物可降解或稀释模板样本中的PCR抑制物;(9)高温温浴后的标本应冷却后再离心，使因加热回流的标本液体能离心至离心管底部;(10)每种试剂都有一定测定范围，待检模板浓度过高时，应稀释10～100倍后在检测;(11)与临床医师及时沟通，了解患者的前期检测结果和用药史。

　　HBV感染后有多种免疫学标志可参考，敏感性和特异性已满足临床应用，目前HBV DNA定量检测一般用于抗病毒疗效评估。如在检测中出现免疫标志与分子生物学标志矛盾时应结合临床的全面情况做出合理解释[2]。

　　【参考文献】

　　1 高俊芬，张翠萍，孙庆国，等.应用荧光PCR技术检测6500例患者血清HBV DNA的实验研究.中国试验诊断学，2002，3：142143.

　　2 申子瑜，李金明主编. 临床基因扩增检验技术.第1版.北京：人民卫生出版社，2004.98,81.