随意引物聚合酶链反应在健康青少年口腔优势菌鉴定中的应用

      作者：吴双燕　孙德刚　马晟利

      【关键词】  随意引物聚合酶链反应

　　［摘要］  目的：应用随意引物聚合酶链反应（arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR）来对健康青少年口腔优势菌进行鉴定。方法：经初步鉴定健康青少年口腔优势菌为血链球菌属后，用随机引物AP-PCR对优势菌进行扩增、检测。结果：经扩增后的健康青少年口腔优势菌的DNA片段与标准血链球菌ATCC10556的DNA片段相同。结论：应用AP-PCR技术可以对健康青少年口腔优势菌进行鉴定和分类。

　　［关键词］  随意引物聚合酶链反应  鉴定  健康青少年  口腔优势菌　　　　Arbitrarily  Primed  Polymerase Chain reaction for Genotypic Identification of Predominant Bacteria In Oral Cavity of Healthy Adolescent.

　　WU Shuang-yan, SUN De-gang, MA Sheng-li.

　　Qing Dao Stomatological Hospital, Qing Dao 266003

　　［Abstract］Objective: To identify predominant bacteria in oral cavity of healthy adolescent by arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR). Methods: After predominant bacteria in oral cavity of healthy adolescent was identified primarily to Streptococcus .sanguis group , AP-PCR was used by designing arbitrary primer 5′AAG AGA GGA GCT AGC TCT TCT TGG A3. Results: The main  DNA ′band of predominant bacteria in oral cavity of healthy adolescent is similar to Streptococcus .sanguis ATCC10556 ′. Conclusion: AP-PCR can be useful in identification of predominant bacteria in oral cavity of healthy adolescent.

　　［Key words］  AP-PCR  Identification  Healthy adolescent  Predominant bacteria in oral cavity

    大量的实验已证实，血链球菌是健康口腔的优势菌［1~3］。血链球菌属包括口腔链球菌、缓症链球菌、高氏链球菌和血链球菌等，这些细菌在口腔中的所具有的特性各不相同［4，5］，这就需要一种快速、准确的方法对血链球菌属进行分类和鉴定，而AP-PCR技术已经被应用到细菌的鉴定中来。本实验利用AP-PCR技术对健康青少年口腔优势菌进行鉴定，为以后深入研究健康青少年口腔优势菌的特性提供实验基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  健康青少年口腔优势菌的分离、培养和初步鉴定  通过普查，取符合条件的健康青少年的龈沟液作为研究对象，分离出优势菌株；通过生化反应实验初步鉴定为血链球菌。

　　1.2  细菌菌种  血链球菌ATCC10556、高氏链球菌ATCC 10558、变形链球菌ATCC 25135，以上菌株均为华西医科大学卫生部口腔微生态重点实验室提供。健康青少年口腔优势菌（简称分离菌）。

　　1.3  试剂和仪器  美国产PCR扩增仪：PTC200型、美国产 GDS-8000型凝胶图象分析仪、美国产DYY-Ⅲ型电泳仪、引物及酶等购于上海生物工程公司。

　　1.4  标准菌株的复苏与增菌  把冻干的血链球菌 ATCC10556、高氏链球菌ATCC 10558和变形链球菌ATCC25135分别在肉汤培养基（加血清和50%葡萄糖）中复苏，然后在BHI-S琼脂培养基上增菌；分离菌也在BHI-S琼脂培养基上增菌。

　　1.5  AP-PCR方法的确定

　　1.5.1  细菌染色体DNA的提取  1）水煮法：挑取适量生长良好的纯化的菌落加到200 μL双蒸水（Eppendorf管）中，配制成细菌混悬液，震荡混匀1 min后，沸水浴15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液备用。2）Chelex100裂解法提取细菌染色体DNA：用无菌接种环分别收集各标准菌株及血链球菌的临床分离株菌落，约一环，置于1.5 mL灭菌Eppendorf管中，加入5%Chelex缓冲液（0.03%SDS,Tween20,1%NP40）混匀，加入20 mg/mL蛋白酶，56 ℃水浴消化2 h，沸水浴15 min，随后立即置于冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液备用；3）酚/氯仿法提取细菌染色体DNA：挑取适量生长良好的纯化的菌落，溶菌酶、2%SDS溶菌，RNA酶处理胞溶物，再以等体积酚/氯仿（1∶1）抽取胞溶物，最后用2倍体积预冷（-20 ℃）无水乙醇沉淀，获得 DNA制品备用。

　　1.5.2  AP-PCR:反应体系50 μL，包括5 μL提取物，每种dNTP各200 μmol/L,MgCl2 1.5~4.5 mmol/L,5 Utap聚合酶，0.3~0.5 μmol/L引物5′AAG AGA GGA GCT AGC TCT TCT TGG A3′。94 ℃预变性5 min，35个循环（94 ℃ 1 min，36 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min）后，72 ℃延伸5 min。取反应产物15 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳35 min，电压10 V/cm,溴化乙锭染色拍照。1：Marker（DL2000），2：S.s ATCC10556(水煮法)，3： S.s ATCC10556(Chelex100裂解法)，4：S.s ATCC10556(酚/氯仿法)，5：高氏链球菌ATCC 10558（Chelex100裂解法），6：高氏链球菌ATCC 10558（酚/氯仿法），7：厌氧条件下分离菌（Chelex100裂解法），8：厌氧条件下分离菌（酚/氯仿法），9：需氧条件下分离菌（Chelex100裂解法），10：需氧条件下分离菌（酚/氯仿法），11：S.mATCC25135（Chelex100裂解法），12：S.mATCC25135（酚/氯仿法），13：空白对照

　　图1  3种方法提取细菌DNA电泳情况　略

　　2  结果

　　2.1  每种细菌都可扩增出稳定、清晰的DNA条带。 S.sATCC10556的主条带位于800bp处，血链球菌临床分离株（包括需氧和厌氧菌）的主条带都位于800 bp处。高氏链球菌ATCC10558的主条带位于500bp处，变形链球菌标准株ATCC25135的主条带位于1000bp处。

　　2.2  同一种血链球菌及分离菌的染色体 DNA分别采用水煮法、Chelex100裂解法和酚/氯仿法进行提取，经过AP-PCR扩增后，可以得到相同的电泳条带，见图1。本实验也说明，需氧和厌氧条件下的口腔优势菌均为血链球菌。

　　3  讨论

    本课题对健康青少年进行普查，筛选出口腔优势菌，研究其对可疑性致病菌的拮抗作用，为口腔微生态调节剂的研制奠定理论基础。通过菌落的大小、形态、颜色，溶血环的有无，革兰氏染色，显微镜下的结构以及各种生化反应试验鉴定此菌为血链球菌属，实际上只通过上面的方法并不能正确的区分血链球菌和其它链球菌属，而血链球菌在感染性心内膜炎中具有潜在致病作用,而不同血链球菌诱导血小板聚集的能力不同［6，7］，各细菌在其他发面的特性也不尽相同，这就需要进一步对血链球菌进行基因分类和分型。本实验采用的AP-PCR技术是根据不同细菌的基因组有差异，扩增后在凝胶上呈现的指纹图谱不同，对细菌进行鉴定和分型的。该技术具有常规PCR技术的快速、简便、安全和灵敏的特点。本实验中我们采用水煮法、Chelex100裂解法及酚/氯仿法提取细菌染色体DNA进行电泳比较，这3种方法的结果基本相同，但水煮法更简单，可操作性更强。

　　参考文献

　　［1］  Hillman JD, Socransky SS. Bacterial interference in the oral ecology of Actinobacillus actinomycetemcomitans and its relationship to human periodontosis ［J］. Arch Oral Biol, 1982, 27(1)∶75-77

　　［2］  Hillman JD, Socransky SS. Replacement therapy for prevention of dental disease ［J］. Adv Dent Res, 1987, 2(2)∶119-125

　　［3］  Fiehn NE, Klausen B, Evans RT. Periodontal bone loss in porphyromonas gingivalis infected specific pathogen-free rats after preinoculation with endogenous Streptococcus sanguis ［J］. J Periodont Res,1992,27(6)∶609-614

　　［4］  潘亚萍，王红杨，林长坤，等.随意引物PCR用于口腔链球菌基因分型的初步研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，1998，8∶77-79

　　［5］  施育才，张卫东，陈晖.随意引物聚合酶链反应在血链球菌菌种鉴定中的应用［J］.上海口腔医学，2003，12∶21-23

　　［6］  Douglas CW, Heath J, Hampton KK. Identify of viridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis ［J］. J Med Microbiol,1993,39∶179-182

　　［7］  Manning JE, Geyelin AJ, Ansmits LM, et al. A comparative study of the aggregation of human,rat and rabbit platelets by members of the streptococcus sanguis group ［J］. J Med Microbiol,1994, 41∶10-13