白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察
发表时间：2009-09-08 浏览次数：677次
作者：鞠全荣 黄丽华 张孝卫 杜德田 耿秀兰 刘宗印 马力 张如胜 任东俊 作者单位：济南市医学科学研究所，山东 济南 250013
【摘要】 ［目的］ 构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体（AdCMVmIL,12），并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。［方法］ 构建重组质粒pdlE1SP1BmIL,12，并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL,12，并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物，通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL,12，观察其抗肿瘤作用。［结果］ 酶切鉴定显示构建正确，其病毒滴度为1.3×109pfu/ml；当病毒滴度为100MOI时，mIL,12浓度达到3 417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明，注射AdCMVmIL,12的小鼠，肿瘤体积明显小于对照组（P<0.01），生存期显著延长。［结论］构建AdCMVmIL,12成功，肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。
【关键词】 白细胞介素12 重组腺病毒 基因表达 肿瘤 小鼠
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株、细胞株和质粒：大肠杆菌DH5α，质粒pCDNA/amp/mIL,12/p35，pCDNA/amp/mIL,12/p40，pCA13，pdlE1SP1B，pJM17，大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC）由美国芝加哥大学提供；人胚肾293细胞由第二军医大学提供；T4 DNA连接酶（Invitrogen），限制性内切酶HindⅢ,Xhol,EcoRⅤ，BglⅡ (TaKaRa)，RNA酶抑制剂（北京华美公司）；昆明种小鼠购自山东大学动物中心，许可证号为SCXY（鲁）20030004；H22由本室保存。
1.2 方 法
1.2.1 质粒制备
用感受态大肠杆菌DH5α常规方法扩增质粒 pCDNA/amp/mIL,12/p35、pCDNA/amp/mIL,12/p40、pCA13、pdlE1SP1B、pJM17。
AdCMVmIL,12的构建：用HindⅢ、Xhol酶切pCDNA/amp/mIL,12/p40，并将其插入HindⅢ、Xhol酶切后的pCA13中，获得pCA13mIL,12/p40；同法用HindⅢ 和EcoRⅤ酶切pCDNA/amp/mIL,12/p35，并将其插入HindⅢ、EcoRⅤ酶切后的pCA13中，获得pCA13mIL,12/p35；将Bgl Ⅱ酶切pCA13mIL,12/p40并补平粘端所得小片段与EcoR1酶切pdlE1SP1B并补平粘端所得大片段通过T4 DNA连接酶连接，得到pdlE1SP1BmIL,12/p40；将Bgl Ⅱ酶切pdlE1SP1BmIL,12/p40所得大片段和Bgl Ⅱ酶切pCA13mIL,12/p35所得小片段连接，得到pdlE1SP1BmIL,12。重组的pdlE1SP1BmIL,12/p40/p35分别含有两个CMV启动子和两个SV40终止信号。用pdlE1SP1B mIL,12转染293细胞，包装并扩增出AdCMVmIL,12。
包装过程：在1ml无血清培养基中加入5μl脂质体（LIPOFECTAMINE）、8μg pJM17及4μg pE1SP1BmIL,12，上述混合液室温放置15min。弃去细胞培养液，用无血清DMEM培养基洗两遍，加入上述混合液，置37℃的CO2培养箱中孵育3~4h，再加入含20% 胎牛血清的DMEM，CO2培养箱中37℃培养。第二天将细胞分至3个培养皿，继续培养，隔天补充0.5ml含10% 胎牛血清的DMEM，注意观察细胞病变效应（CPE）的出现。包装好的腺病毒为AdCMVmIL,12。转染前正常293细胞呈梭状，连接成片。转染后293细胞固缩成团、部分细胞裂解。
1.2.2 对重组腺病毒鉴定
用限制性内切酶HindⅢ和Xhol对重组腺病毒DNA进行常规酶切鉴定。
1.2.3 重组腺病毒的扩增和滴度测定
取经酶切鉴定正确的AdCMVmIL,12感染293细胞，大量扩增AdCMVmIL,12。将扩增后的病毒液做倍比稀释，在96孔板上感染293细胞进行病毒滴定，观察每孔中的细胞病变效应（CPE）。以出现CPE的最高稀释度为病毒滴度。
1.2.4 AdCMVmIL,12的生物学活性检测
取1×106大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC），用500μl滴度为100MOI（感染复数）的AdCMVmIL,12感染1h，被感染的细胞经过无血清培养基洗3遍后在96孔板上培养。24h后收集上清（内含mIL,12）待检测。同时用重组mIL,12作为阳性对照，用含有荧光素基因重组腺病毒（AdCMVLuc）感染后的rMTC培养上清作阴性对照。
1.2.5 AdCMVmIL,12抑瘤性实验
注射1×106个H22细胞于昆明种小鼠皮下，并在长成的瘤体内分别注射 AdCMVLuc 和AdCMVmIL,12（含1×109pfu）稀释液。注射当天为0天，每隔1天观察1次肿瘤生长情况，并用卡尺测量肿瘤最小直径（a）和最大直径（b），按照公式（V=a2·b/2）计算肿瘤体积。观察AdCMVmIL,12对H22的抑制作用。
2 结 果
2.1 AdCMVmIL,12用限制性内切酶HindⅢ和Xhol作酶切鉴定
在1 644bp处出现目的基因电泳条带，经过比对与预想的基因片段完全相同，证明包装的腺病毒是完全正确的，酶切结果见图1。
2.2 AdCMVmIL,12的生物学活性测定
结果显示AdCMVmIL,12能够在体外诱导细胞分泌mIL,12，当病毒滴度为100MOI时，mIL,12浓度达到3 417ng/1×106细胞/24h。
2.3 AdCMVmIL,12对H22抑瘤性实验
AdCMVmIL,12对H22抑瘤性实验结果见表1。
3 讨 论
IL,12是由两个不同亚单位p35和p40形成的异二聚体。IL,12对NK和T细胞发挥有效的细胞免疫作用[3]。以往的研究报告指出，IL,12虽然有抗肿瘤作用，但在直接注射达到治疗水平的浓度时具有很强的毒副作用[2]，使治疗无法继续进行,达不到彻底治疗肿瘤的目的。构建能携带IL,12 基因的载体，使得IL,12基因能高效、稳定地表达是人们追求的目标。腺病毒具有广谱、高效感染肿瘤细胞的能力，且不整合到宿主染色体，安全性高等优点，是一种比较理想的载体[4~6]。我们在研究中将p35和p40基因插入腺病毒DNA的E1区，构建了携带小鼠IL,12基因的重组腺病毒AdCMVmIL,12，采用两个相同效率的启动子分别启动p35和p40两个基因，从而使得p35和p40两个亚单位同比例地高效表达，从而合成具有高效生物活性的IL,12。而且该重组腺病毒不仅E1基因缺失而且E3基因也缺失，使得其毒性更加降低，因而使用时更加安全可靠。本实验获得的AdCMVmIL,12，通过酶切、病毒生物学活性等技术检测，均证明构建的AdCMVmIL,12是正确的，并具有很高的病毒滴度。关于AdCMVmIL,12在体外能否抑制肿瘤细胞的生长，目前还没有肯定的结论。董炎鑫等[7]的实验提示在体外条件下AdCMVmIL,12对前列腺癌细胞的增殖能力无影响，最近，薛绪潮等[8]研究发现，携带mIL,12基因的增殖型腺病毒有增强化疗药物敏感性的作用。在体外实验中，化疗药物与增殖型腺病毒的协同增强了两者对胃癌细胞株的杀伤作用。而本课题获得的AdCMVmIL,12具有很高的病毒滴度。通过制备H22肿瘤模型，在瘤体内局部注射AdCMVmIL,12后第8天开始，肿瘤体积明显地小于对照组，AdCMVmIL,12对H22肿瘤生长具有明显抑制作用，差异具有显著性（P<0.01）。初步实验结果证明AdCMVmIL,12对H22具有明显的抗肿瘤作用，至于对其它肿瘤是否具有抑制效果还要通过更多的实验来证实。
【参考文献】[1] Menitti R, Parronchi P, Giudizi M, et al. Natural killer cell stimulatory factor(IL,12) induces T helper type 1(Th1),specific immune reponses and inhibits the development of IL,4 producing Th cell[J].J Exp Med,1993,177:1199-1204.
[2] Leonard JP, Sherman ML, Fisher GL, et al. Effects of single,dose interleukin,12 exposure on interleukin,12 associated toxicity and interferon,gamma production[J]. Blood,1997,90:2541-2548.
[3] Nanni P, Rossi I, Giovanni CD, et al. Interleukin,12 gene therapy of MHC,negative murine melanoma metastases[J]. Cancer Res,1998,58:1225-1230.
[4] Robbins PD, Ghivizzani SC. Viral vectors for gene therapy[J]. Pharmacol Ther,1998,80:35-39.
[5] Massie B, Mosser DD, Koutroumanis M, et al. New adenovirus vectors for protein production and gene transfer[J]. Cytotechnology,1998,28:53-57.
[6] Romano G,Pacilio C,Giordano A. Gene transfer technology in therapy: Current applications and future goals[J]. Stem Cells,1999,17:191-194.
[7] 董炎鑫，曹广文，潘卫,等. 转单链鼠白介素12基因前列腺癌RM,1细胞的致瘤性观察[J].中国男科学杂志,2002,16(2):90-97.
[8] 薛绪潮，方国恩，王星华,等. 携带小鼠白介素12的增殖型腺病毒对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究[J]. 中华胃肠外科杂志，2005，8（2）：165-168.
