B细胞淋巴瘤SHP-1基因甲基化状态及其意义
发表时间：2009-06-24 浏览次数：830次
作者：汪清铭， 吴祥元， 王东宁， 林 曲， 董 敏， 温景芸
作者单位：（ 中山大学附属第三医院肿瘤内科， 广东 广州 510630 ）
【摘要】 【目的】探讨JAK/STAT信号转导途径负调控子SHP-1基因启动子区域CpG岛异常甲基化在B细胞淋巴瘤中的意义。【方法】 收集存档石蜡包埋组织标本61例（52例B细胞非霍奇金淋巴瘤标本，9例良性增生淋巴结标本），健康人外周血单个核细胞DNA标本15例，用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）和非甲基化特异性PCR（unmethylation-specific PCR,un-MSP）检测SHP-1启动子区域CpG岛甲基化状态，MSP、un-MSP和RT-PCR方法分别检测接受或未接受去甲基化处理的Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的甲基化状态及mRNA的表达， MTT法检测接受去甲基化干预后细胞生长受抑情况。【结果】 SHP-1基因启动子区域在弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤甲基化频率分别为94％及97％，对照组9例淋巴结良性增生标本和15例正常人外周血单个核细胞标本中SHP-1基因启动子区域甲基化频率为0。经去甲基化干预后，Raji细胞SHP-1基因启动子区域呈去甲基化状态，基因恢复表达，细胞生长受到抑制。【结论】 SHP-1基因启动子区域启动子区域CpG岛在B细胞淋巴瘤中存在高度甲基化，由其所致的SHP-1基因沉默可能是B细胞淋巴瘤发生的一个重要因素，SHP-1基因的甲基化可作为一个良好的分子诊断标记及可能的治疗靶点。
【关键词】 淋巴瘤； SHP-1； 甲基化
Significance of Methylation State in SHP-1 Gene in B-cell Lymphoma
WANG Qing-ming, WU Xiang-yuan, WANG Dong-ning, LIN Qu, DONG Ming, WEN Jing-yun
( Department of Oncology, The Third Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630，China )
Abstract: 【Objective】 To investigate the methylation state of CpG island in the SHP-1 gene promoter which is one of the negative regulators of JAK/STAT signaling pathway and to evaluate its significance in B-cell lymphoma. 【Methods】 Sixty-one paraffin specimens including 52 specimens of B-cell non-Hodgkin lymphoma and 9 specimens of benign lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals were studied, methylation state of CpG island in SHP-1 gene in the specimens and Raji cell line were detected by methylation specific PCR(MSP) and unmethylation-specific PCR(un-MSP). The expression level of SHP-1 in Raji cells with or without 5-aza-2'-deoxyoytidine treatment were detected by reverse transcriptase PCR(RT-PCR).The inhibitory ratio of Raji cells were measured by MTT assay. 【Results】 The frequency of methylation in SHP-1 gene promoter in large B-cell lymphoma(DLBCL) and follicular lymphoma(FL) were 94% and 97%,respectively.In control group, however,9 specimens of benign lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals showed no methylation in CpG island of SHP-1 gene promotor（P< 0.0001）. The expression of SHP-1 was recovered and the cell growth was inhibited when the cell exposed to the demethylating reagent. 【Conclusion】 SHP-1 gene silencling with aberrant CpG methylation is probably one of the critical events to the onset of B-cell lymphoma as well as important implications for the diagnostic markers and the target of gene therapy.
Key words: lymphoma; SHP-1; methylation
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 92-96] SHP-1是一种天然存在于胞浆内的酪氨酸磷酸酶，其通过催化受体相关酪氨酸激酶（Janus Kinase, JAKs）去磷酸化导致JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号转导途径活性下调，是JAK/STAT途径主要负调控子之一，可对抗蛋白酪氨酸激酶的潜在促生长和致癌活性，因此，近年来有学者认为其可能是候选的抑癌基因[1]。研究表明，基因启动子区域异常甲基化可导致基因沉默，抑癌基因的甲基化及由其所导致的抑癌基因失表达促进肿瘤的发生发展。本研究检测B细胞恶性淋巴瘤中SHP-1基因的甲基化状态，并对Raji细胞系进行去甲基化干预，观察肿瘤细胞SHP-1基因表达情况及其生长状态的改变，探讨SHP-1基因甲基化在B细胞淋巴瘤发生发展中的意义，为B细胞淋巴瘤的诊断和治疗提供新的方向。
1 材料和方法
1.1 细胞系与病例
Burkitt淋巴瘤细胞系Raji由中山大学肿瘤防治中心馈赠。52例B细胞非霍奇金淋巴瘤标本为本院1999年～2005年间存档石蜡标本，所有标本均经病理组织形态学及免疫组化确诊。滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）35例，弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）17例，男33例，女19例，年龄18～72岁，平均45.6岁。9例良性非特异性慢性淋巴结炎石蜡包埋组织标本和15例健康人外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells ，PBMC）标本作为对照组。
1.2 试 剂
UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒、Trizol购自上海生工生物工程公司，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit为日本TaKaRa公司产品，Wizard DNA Clean-up system、MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品，MSP阳性对照CpGenome Universal Methylated DNA 购自美国Chemicon公司。
1.3 DNA的提取
用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取石蜡组织DNA，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit用于细胞系基因组DNA的提取，紫外分光光度仪确定DNA含量及纯度。
1.4 甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR分析
1.4.1 亚硫酸氢钠修饰DNA DNA1.5 ?滋g，三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液调整体积至50 ?滋L，加新鲜配制的3 mol/L NaOH（终浓度0.3 mol/L） 37 ℃ 15 min使DNA变性,向已变性的DNA中加入520 ?滋L 3.6 mol/L亚硫酸氢钠和30 ?滋L 10 mmol/L氢醌， 55 ℃避光水浴16 h。然后用Wizard DNA Clean-up system 纯化DNA,最后用3 mol/L NaOH,3 mol/L醋酸氨进行亚硫酸氢钠后处理，乙醇沉淀DNA,溶解于50 ?滋L 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液中，-20℃避光保存备用。
1.4.2 PCR扩增 SHP-1基因甲基化引物:上游:5＇-GAA CGT TAT TAT AGT ATA GCG TTC-3′ (nt:6857-6880);下游:5′-TCA CGC ATA CGA ACC CAA ACG-3′(nt:7015-6995);扩增产物长度:159 bp。扩增条件：94 ℃预变性12 min， 55 ℃退火， 35个循环。SHP-1基因非甲基化引物:上游：5′-GTG AAT GTT ATT ATA GTA TAG TGT TTG G-3′(nt:6855-6882);下游：5′-TTC ACA CAT ACA AAC CCA AAC AAT-3′(nt:7016-6993);扩增产物长度:162 bp。扩增条件：94 ℃预变性12 min， 58 ℃退火， 35个循环。20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶成像系统观察结果。
1.5 去甲基化干预
用含100 ｍL/L胎牛血清的R?妆?赚?砖1640培养基常规培养Raji细胞，细胞按5×104 /mL起始浓度培养于去甲基化试剂5-aza-2，-deoxyoytidine终浓度为1 ?滋mol/L的培养液中，每天更换培养液及去甲基化试剂，以未加去甲基化试剂的细胞为对照，培养第3天后提取DNA,第3、5天后提取RNA,观察基因甲基化状态及表达。
1.6 RT-PCR
Trizol提取Raji细胞总RNA,用随机引物、MMLV逆转录酶等合成cDNA，按试剂说明书进行操作。SHP-1引物：上游：5′-GAC TGT GAC ATT GAC ATC CAG-3′;下游：5′-CTT CCT CTT GAG GGA ACC CTT-3′,产物长度：350 bp；β-actin引物：上游：5′-CAC TGT GTT GGC GTA CAG GT-3′，下游：5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′;产物长度：154 bp，扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32个循环,72 ℃延伸7 min,以β-actin为内参照。20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶成像系统观察结果。
1.7 细胞生长抑制率的测定
用噻唑蓝还原法检测，取已被5-aza-2′-deoxyoytidine（1 umol/l）作用2 d并处于对数生长期的Raji细胞,调整细胞浓度为5×104 /mL,接种细胞于96孔板,每孔加入细胞悬液200 μL（细胞104 /孔）, 加去甲基化试剂5-aza-2′-deoxyoytidine，终浓度分别为0、1、2、4 μmol/L，每种药物浓度为1组,每组设6个平行孔,并设空白对照组。细胞培养20、32、44、56 h后加噻唑蓝(5 mg/mL)20 μL,继续培养4 h, 离心去上清后每孔加DMSO 150 μL,以570 nm为测试波长,630 nm为参考波长,读取吸光度A值,取各复孔吸光度均值，实验重复3次,细胞生长抑制率=(对照组A值- 实验组A值)/对照组A值×100%。
1.8 统计学分析
用SAS V8软件行卡方检验。
2 结 果
2.1 SHP-1基因启动子区域甲基化检测结果
17例弥漫性大B细胞淋巴瘤标本16例存在SHP-1基因启动子区域甲基化，甲基化频率为94％；35例滤泡性淋巴瘤标本34例存在该区域甲基化，甲基化频率为97％；而对照组标本均为非甲基化状态，?字 2分别为37.045及55.022，P＜ 0.0001。电泳图（图1）MSP呈阳性条带，unMSP呈阴性条带提示该标本基因启动子区域呈甲基化状态；如unMSP呈阳性条带MSP呈阴性条带，则说明该标本基因启动子区域呈非甲基化状态。电泳结果均经测序证实，MSP阳性条带测序示CpG岛CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修饰后仍旧为C,证实该位点为甲基化状态；unMSP阳性条带测序示CpG岛CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修饰再经PCR扩增后变为T，证实该位点呈非甲基化状态。
2.2 去甲基化干预致Raji细胞SHP-1基因甲基化状态改变
未接受去甲基化干预的Raji细胞SHP-1基因启动子区域呈甲基化状态，MSP呈阳性条带，而UN-MSP呈阴性条带；干预后分析显示该区域呈非甲基化状态，MSP呈阴性条带，而UN-MSP呈阳性条带（图2）。
2.3 去甲基化干预致Raji细胞SHP-1基因表达水平改变
未接受去甲基化干预的Raji细胞SHP-1基因失表达，干预后恢复表达,目的条带350 bp，以β-actin为内对照(图3)。
2.4 去甲基化干预致Raji细胞生长受抑
Raji细胞经去甲基化药物处理后生长明显受抑制(图4)。
3 讨 论
DNA甲基化是哺乳动物遗传外修饰的重要调控方式，在基因表达调控，基因结构的稳定等方面有着重要的作用。研究表明，DNA甲基化模式改变与肿瘤形成有着密切的关系[2]。肿瘤细胞与正常细胞相比，DNA甲基化模式显著不同，表现为整个基因组的低甲基化与某些特异性位点如启动子CpG岛高甲基化并存。肿瘤形成最基本的遗传性模式是原癌基因过度扩增与抑癌基因的沉默，细胞增殖平衡受到破坏而导致细胞的恶性状态，抑癌基因沉默与其启动子区域高甲基化有关。现已发现多个基因的启动子区域甲基化与肿瘤的发生有关，如DAP-K、P15、P16、P73、MTS1基因等[3,4]。
JAK/STAT信号转导途径参与细胞增殖、分化、胚胎发育及机体免疫等生物学作用的相关调控。研究发现，该途径异常激活与淋巴瘤发生发展关系密切，但其异常激活的具体机制尚未完全明确[5]。SHP-1基因为存在于胞浆中的一种酪氨酸磷酸酶，是JAK/STAT信号转导途径负调控子之一。SHP-1基因沉默可以导致相关信号转导分子活性增强，从而促进肿瘤发生。
Oka等[6]通过表达谱芯片及组织微阵列技术证实SHP-1基因在恶性淋巴瘤中表达明显下降。本研究初步结果显示SHP-1基因启动子区域甲基化在B细胞淋巴瘤中发生频率高，这是否与SHP-1基因表达下调从而导致JAK/STAT信号转导途径失调有关，需进一步研究。
恶性淋巴瘤的病理诊断难度较大，主观性强，尤其是细胞、组织结构异型性尚不明显时，良、恶性增生往往难以鉴别,甲基化检测方法MSP灵敏度高，对甲基化等位基因的检测灵敏度能够达到10﹣3～10﹣5 [7]。本研究52例B细胞淋巴瘤组织中50例存在SHP-1基因启动子区域高甲基化，而在9例良性增生淋巴结组织及15例正常人PBMC标本中，该基因相应区域均为非甲基化状态，可见，SHP-1基因异常甲基化在B细胞恶性淋巴瘤的发生过程中是一个普遍事件，SHP-1基因启动子区域甲基化检测可以作为B细胞淋巴瘤的一种有希望的辅助诊断手段。
FL是一种常见的低度恶性非霍奇金淋巴瘤（NHL）,有约60%最终转化为DLBCL,DLBCL目前治疗主要方法为化疗，常规化疗疗效欠佳，自体干细胞移植支持下的大剂量化疗（HDT-AHSCT）已取得良好疗效，但耗资较大，且仍有部分病例复发，所以探索新的治疗方法显得尤为重要，去甲基化治疗作为一种新的治疗手段，在急、慢性髓系白血病以及骨髓增生异常综合征（MDS）的治疗中取得了成功[8-10]，本研究对Raji细胞系进行去甲基化干预试验，干预后细胞SHP-1基因恢复表达，细胞生长明显受抑，提示SHP-1是一个有前景的候选基因治疗靶点。初步结果提示针对SHP-1基因的去甲基化治疗有可能成为治疗B细胞淋巴瘤有希望的手段之一。
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