质量放大压电免疫传感器法测定人血清胸苷激酶的临床实验

作者：周颖    作者单位：430033 武汉，湖北省中山医院中心实验室     【关键词】  胸苷激酶 质量放大压电免疫传感器 临床诊断 

    胸苷激酶 (thymidine kinase ,TK )是 DNA 合成过程中的重要激酶，与细胞的分裂和增殖有密切关系。TK 有两种主要同工酶，TK1 存在于细胞质，而 TK2 存在于线粒体。虽然体液中TK的来源和机制尚不清楚, TK蛋白本身没有信号肽，但是推测体液中的TK很可能是细胞崩解或肿瘤细胞分泌产生的，因此，TK可以作为细胞生长旺盛的一个指标。有观点认为，TK 的升高或减低与肿瘤的发生、发展、转移有密切关系[1，2]。本研究小组[36]用 DNA 重组技术克隆了 TK 基因，在大肠杆菌中表达了 TK， 通过免疫 Balb/C 小鼠制备单克隆抗体，并建立了一种用于 TK 检测的质量放大压电免疫传感器。本实验采用质量放大压电免疫传感器方法检测了健康人、良性肿瘤以及肝癌、胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤患者血清中的TK，旨在探讨质量放大压电免疫传感器方法检测血清中 TK 以及将其作为恶性肿瘤新型标志物的可行性，为进一步将 TK 检测用于的恶性肿瘤临床诊断奠定基础。

    1  资料与方法

    1.1  病例选择

    实验标本均来自湖北省中山医院和湖北省肿瘤医院的肿瘤患者血清。其中肝癌69例，男61例，女8例，年龄23～80岁，平均年龄（53.65±12.25）岁；胃肠恶性肿瘤39例，男22例，女17例，年龄28～81岁，平均年龄（61.89±15.33）岁；肺癌25例，男17例，女8例，年龄36～75岁，平均年龄（57.33±11.25）岁；生殖系统恶性肿瘤26例，男6例，女20例，年龄36～75岁，年龄25～82岁，平均年龄（55.52±13.61）岁；乳腺癌13例，均为女性，年龄37～64岁，平均年龄（49.70±8.05）岁；其他恶性肿瘤21例（胆管癌5例，胰头癌6例，肾癌1例，脑转移癌1例，鼻咽癌3例，胰腺癌1例，恶性胸水1例，胃癌肺转移1例，颌下腺癌1例，腺癌淋巴转移1例），男11例，女10例，年龄41～83岁，平均年龄（57.25±17.57）岁；良性肿瘤患者血清15例，男4例，女11例，年龄27～70岁，平均年龄（47.60±10.13）岁；健康人血清30例，男13例，女17例，所有血清样品均为医院常规采集的清晨静脉血分离得到，收集后贮于-20℃冰箱中。

    1.2  仪器与试剂

    CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电器厂)；石英晶振：AT 切割(JA5型)，9MHz，两面被金电极，芯片直径12mm，电极直径6mm，振荡电路为实验室自制TTL电路。TK、抗TK单克隆抗体(AntiTKAb)和辣根过氧化物酶标记抗TK单克隆抗体（HRPAntiTKAb）均为本研究组制备，方法已另文报道[35]。

    1.3  方法

    按本研究组报道的质量放大压电免疫传感器方法[6]，将本研究组制备的AntiTK Ab通过巯基自组装膜共价固定于压电石英晶振表面，制备得到hTK压电免疫传感器，将血清样品以1∶1稀释进行测定。

    1.4  统计学方法

    进行t检验处理，分别计算不同恶性肿瘤血清与正常人血清、恶性肿瘤血清与良性肿瘤血清以及良性肿瘤血清与正常人血清的频移值之间的统计量t，分析其间差异性。

    2  结果

    2.1  TK血清学检测标准曲线

    测量了一系列不同浓度的TK溶液（用TK纯品配制），得到了TK浓度与传感器频率响应的关系曲线，见图1。通过线性回归分析，得到频移值与TK浓度的线性相关方程，Y=77.4-14.7X，γ=0.9955。

    图1  传感器频率响应与 TK 浓度的标准曲线

    2.2  TK血清学检测

    采用质量放大压电免疫传感器方法对不同恶性肿瘤血清、良性肿瘤血清以及正常人血清进行了检测，见表1。结果显示，肝癌血清的TK水平最高，69例肝癌血清的平均频移值为（59.4±3.38）Hz，TK水平为（2.44±0.46）ng/ml；其次为乳腺癌血清，其频移值为（68.9±1.75）Hz，TK水平为（1.16±0.24）ng/ml。两者的TK水平存在显著性差异。表1  临床样品的TK 血清学检测结果 a：与正常人血清对照；b：与良性肿瘤血清对照；c：与乳腺癌血清对照；d：与其他恶性肿瘤血清对照；-：浓度低于线性范围同时，两者的TK水平均明显高于其他恶性肿瘤血清（P<0.001）。肺癌、胃肠恶性肿瘤、生殖系统恶性肿瘤以及其他恶性肿瘤血清间的TK水平接近，差异无统计学意义（P>0.05）。而良性肿瘤患者血清与正常人血清的TK水平更低，低于传感器的线性检测范围，实验中所有恶性肿瘤血清样品的频移值与其比较差异有统计学意义（P<0.001）。此外，良性肿瘤血清的频移值亦显著大于正常人血清，TK水平差异有统计学意义（P<0.001）。

    3  讨论

    TK 能可逆性催化胸腺嘧啶脱氧核苷与磷酸脱氧核苷之间的转化，与细胞的分裂和增殖有密切关系，是一种较为敏感的新的肿瘤标志物[1，2]。目前国际上仍主要采用放射免疫法测定血清 TK的活性和含量, 但是长期采用放射性方法，存在一定的放射性污染，且需要比较昂贵的仪器设备和放射性试剂，难以在临床诊断和普查中推广应用。

    本研究组自主制备得到了TK和相应的抗TK单克隆抗体，并将抗TK单克隆抗体固定于压电石英晶振表面，研制的质量放大TK压电免疫传感器。这种传感器方法灵敏度高、操作方便，易于实现自动化、数字化，无需昂贵的仪器设备，所用的试剂用量少、价格低廉，而且线性回归分析结果显示，传感器的频移响应与 TK 浓度具有很好的相关性（γ=0.9955），可准确得到TK浓度的信息。在此基础上，本实验测量了一系列不同类型肿瘤血清样品的TK水平，结果显示表明无论是恶性肿瘤还是良性肿瘤患者血清的频率响应均比健康人血清大，表明肿瘤患者由于细胞的过度增生，TK作为DNA合成的关键酶与细胞分裂密切相关，表达的TK蛋白迅速增加，血清中TK水平亦明显升高，与健康人血清差异有统计学意义。同时，我们尚发现不同类型的恶性肿瘤血清样品，其TK水平亦有明显的区别，其中肝癌血清最高（2.44±0.46）ng/ml，其次为乳腺癌血清（1.16±0.24）ng/ml，两者的TK水平差异有统计学意义，且均明显高于其他恶性肿瘤血清（P<0.001）。而肺癌、胃肠恶性肿瘤、生殖系统恶性肿瘤以及其他恶性肿瘤血清间的TK水平接近，差异无统计学意义（P>0.05）。可见TK完全可以作为肿瘤普查的一个通用指标，并且可方便地定性区别肝癌、乳腺癌、其他恶性肿瘤和良性肿瘤，因此，本实验应用的质量放大 TK压电免疫传感器法作为一种简便灵敏的TK测定新方法，有望推广应用于临床肿瘤普查以及区分肿瘤类型，尤其在肝癌、乳腺癌临床诊断的方面具有良好的应用前景。 

    【参考文献】［1］ Kim YK, Lee AS. Idetification of a proteinbinding site in the promoter of the human thymidine kinase gene required for the G1Sregulated transcription [J]. J Biol Chem, 1992，267（4）：27232727.

［2］Aner ES, Eriksson S. Mammalian deoxynucleoside kinase [J]. Pharmac Ther, 1995，67（2）：155186.

［3］ 丁克祥, 郑永晨, 吴朝阳, 等. 人胸苷激酶基因 cDNA 克隆 [J]. 中国老年学杂志, 2004，24（10）：932934.

［4］ 丁克祥, 郑永晨, 吴朝阳, 等. 人胸苷激酶基因在大肠杆菌中的表达 [J]. 中国老年学杂志, 2004，24（11）：10291031.

［5］ 丁克祥, 郑永晨, 吴朝阳, 等. 人胸苷激酶单克隆抗体的制备 [J]. 中国老年学杂志, 2005，25（1）：5455.

［6］ 丁克祥, 吴朝阳, 郑永晨，等. hTK1质量放大压电石英晶体免疫传感器研究 [J]. 中国老年学杂志, 2005，25（9）：10641067.