建立人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型不同方法的比较

　　作者：文庆莲,吴敬波,范娟,郎锦义　　作者单位：1. 四川,泸州医学院附属医院肿瘤科;2. 四川省肿瘤医院放疗科

　　【关键词】 鼻咽癌;皮下移植瘤模型;裸鼠

　　基金项目：四川省科委基金项目(41)

　　0 引言

　　鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,很多体内实验研究都需要建立裸鼠移植瘤模型,寻找一种简单、高效的造模方法,将为鼻咽癌的研究带来方便。本研究即选用了几种常用的皮下移植瘤的造模方法,比较其成瘤率,组织学变化,增殖动力学变化,既往相关报道较少，其结果将为广大研究者提供参考，现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物及克隆株

　　免疫功能缺陷型Balb/C裸鼠，鼠龄4周，体重20～25g，雌雄各半,人鼻咽癌高分化细胞系(CNEI)，均由四川大学华西医学中心提供。

　　1.2几种不同的移植瘤模型的建立方法

　　初代移植瘤接种方法:指数生长期CNEI细胞消化后，调整细胞浓度至7×106/ml，取0.2ml接种于裸鼠双侧腋下，共3只。初代移植瘤生长至1cm×1cm×1cm时，选择接种成功的2只裸鼠，采用脊髓离断法处死动物，无菌剥离瘤体，除去包膜，用0.9%生理盐水洗涤2次，剪成2mm×2mm×2mm大小瘤块。

　　1.2.1细胞悬液接种法同初代移植瘤接种法，接种8只。

　　1.2.2新鲜组织块接种法将剥离的瘤体剪成2mm×2mm×2mm大小的瘤块，用套管针接种于裸鼠的右前腋下，接种标本在离体后5分钟内完成，接种8只。

　　1.2.3冻存组织块接种法将剥离的瘤体剪成2mm×2mm×2mm大小瘤块，按常规方法处理后无菌包装冻存于-70℃液氮罐内，冻存2周后按组织块复苏法复苏，用套管针将其接种于裸鼠的右前腋下，接种标本在复苏后5min内完成，接种8只。

　　1.2.4细胞匀浆接种法将剥离的瘤体剪碎，加入生理盐水2ml，先后用300目和500目铜网各过滤一次，制备成单细胞悬液，进行活细胞计数后接种于裸鼠的右前腋下，每只接种0.2ml(约含1.4×106个活细胞) ，接种8只。

　　1.3观察指标

　　1.3.1移植瘤生长曲线自接种日起,每周测量1次肿瘤长径(b),短径(a),按公式V=1/2a2b计算肿瘤体积,共观察6周,绘制生长曲线图,根据生长曲线计算各种方法的成瘤率(接种成功率/接种只数)，成瘤潜伏时间(接种日至长出肉眼可见的肿瘤时间)，肿瘤体积倍增时间(TD=0.1*t/logDtlogDo,Do为第一次测得的肿瘤直径,Dt为经过t时间后肿瘤直径。

　　1.3.2组织学方法第6周后处死裸鼠,剥离肿瘤,先对剥离的肿瘤行大体观察,然后用10%福尔马林固定,石蜡包埋切片HE染色,光镜下观察。

　　1.3.3细胞周期动力学检测采用介绍的方法制备单细胞悬液，然后用流式细胞仪检测，采用Barlogie细胞周期分析法。

　　1.3.4统计学处理数据处理用SPSS10.0进行分析。

　　2结果

　　2.1每组选8只裸鼠接种，CNEI接种后成瘤率较高(62.5%～100%),接种相对容易,而各组成瘤潜伏时间差异较大,新鲜组织块成瘤率为100%,潜伏时间2～4d，肿瘤体积倍增时间为(9.81±1.78)d，可以看出此方法实用性较高，与其他三种方法比较有统计学意义(P<0.05)。而细胞悬液接种法成瘤潜伏时间较长(8～10d)，冻存组织块复苏后接种仍然可以形成肿瘤，适用于需要保存肿瘤标本的实验，细胞匀浆接种后成瘤率最低(62.5%，P<0.05)。根据移植瘤生长曲线计算出成瘤率(接种成功率/接种只数)，成瘤潜伏时间(接种日至长出肉眼可见的肿瘤的时间)，肿瘤体积倍增时间,结果见表1。表1 各组的成瘤率和成瘤潜伏时间及肿瘤体积倍增时间(略)注：组间比较采用方差分析

　　2.2各组移植瘤组织学情况

　　肉眼观察得出：新鲜组织块接种法由于接种时的组织块大小很难完全一致，所以形成的肿瘤大小有一定的差异，而细胞悬液接种法由于接种的细胞数基本一致,所形成的肿瘤体积比较均匀。肿瘤标本制成病理切片后观察组织学改变，各治疗组瘤组织呈鳞状细胞癌特征，符合人鼻咽高分化鳞癌细胞系的特点,各组无明显差别。

　　2.3移植瘤的细胞动力学改变

　　各组移植瘤第6周末的细胞周期分布G0/ G1 期,S期,G2/M期分布比例基本相同,各组差异无统计学意义(P<0.05),见表2。表2各组移植瘤的细胞周期分布情况(略)

　　3讨论

　　目前认为人体恶性肿瘤移植于裸鼠体内后,移植瘤组织学表现和原始肿瘤基本一致,染色体核型,生化指标稳定。皮下移植瘤模型基本反映了人恶性肿瘤的体内特征。

　　在肿瘤的研究中动物实验(体内研究)是过渡到临床研究最重要的部分，建立裸鼠移植瘤模型在肿瘤研究中十分重要[1]。如何提高接种后的成瘤率和裸鼠使用率，缩短实验周期是本实验所研究的内容。从实验结果可以看出，新鲜组织块成瘤率最高，成瘤潜伏时间短，肿瘤体积倍增时间短，此方法实用性较高，但由于接种的组织块大小很难完全一致，所以形成的肿瘤大小有一定的差异，而细胞悬液接种法成瘤潜伏时间较长，但由于接种的细胞数可以基本一致，所形成的肿瘤体积比较均匀，适用于体积一致性要求较高的实验，而冻存组织块复苏后接种仍然可以形成肿瘤，适用于需要保存肿瘤标本的实验，细胞匀浆接种后成瘤率较低，可能与制作匀浆过程中细胞损害较大有关。

　　本实验所选用4周龄裸鼠，未对裸鼠的年龄对成瘤率的影响进行研究，程枫等[2]报道2周龄裸鼠移植瘤的成瘤性较3周龄为优，认为选用年龄较小的裸鼠可以提高移植瘤的成瘤率。

　　能否保持肿瘤的原有特征是移植瘤模型成功的关键。Blum[3]观察到肺癌裸小鼠在传代过程中生物学特征不稳定，在移植过程中原有标志物丢失，或产生新的标记物，所以建立裸鼠移植瘤模型应保持生物学行为稳定。本试验几种方法建立的皮下移植瘤模型在组织学，倍性分析， 超微结构上均与鼻咽高分化鳞癌保持一致，故这几种方法都是可行的。

　　【参考文献】

　　[1]郑秀龙，金一尊，沈瑜，等.肿瘤治疗增敏药[M].第2版.上海科学技术文献出版社,2002.125127.

　　[2]程枫，钱关祥，陈诗书.提高胃腺癌组织裸小鼠移植瘤成功率的几种方法选择[J].上海实验动物科学,2001,23 (1)：2932.

　　[3]Blum U.Immunohistochemical detection of tumor markers in lung carcinomas:change of markers after heterotransplantation of the carcinomas in thymus aplastic mice[J].Int J Immunophanmacol,1995,17(2):257259.