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    《肿瘤学》

    KLF4、KLF6在胃癌中的表达及临床意义

    发表时间：2012-11-05  浏览次数：578次

    　　作者：许越平,李勇,范立侨,赵群,王力利　　作者单位：河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050011

    　　【摘要】目的探讨KLF4、KLF6在胃癌组织中的表达与胃癌临床生物学行为的关系及意义。方法RTPCR技术检测36例胃癌手术切除标本癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜内KLF4、KLF6的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系，采用SPSS11.5软件进行统计学处理。结果 胃癌组织中KLF4、KLF6的表达明显低于正常组织(P<0.05);胃癌组织中KLF4的表达在无淋巴结转移组中显著高于淋巴结转移组(P<0.05); KLF6的表达随分化程度的增加，TNM分期的增加而显著降低(P<0.05)，无淋巴结转移组显著高于淋巴结转移组(P<0.05，P<0.01)。结论 KLF4、KLF6在胃癌组织中低表达可能与胃癌的发生、发展、转移、预后有关。

    　　【关键词】 胃肿瘤;KLF4;KLF6;逆转录聚合酶链反应

    　　Kruppe样因子4(KLF4)是KLF家族C2H2型锌指转录因子，在胃肠道中呈现高度表达。人KLF4基因定位于染色体9q31，编码一个由470个氨基酸组成的蛋白质。有研究显示，KLF4在结肠癌〔1〕、食管癌〔2〕组织中明显低表达。KLF6基因定位于人类染色体10p15，有5个外显子和4个内含子。有报道KLF6与肿瘤细胞多种生物学行为有关〔3〕。但迄今关于KLF4、KLF6在胃癌中的表达情况尚无报道。本研究采用RTPCR方法检测胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中KLF4、KLF6的表达，及其与肿瘤临床病理学行为的关系，并对二者在胃癌中的意义进行了探讨。

    　　1 材料与方法

    　　1.1 研究对象

    　　河北医科大学第四医院2007年1～7月手术切除胃癌标本36例，所有标本均经术后苏木素伊红(HE)染色病理证实，临床资料完整，按全国胃癌诊疗规范统计分析临床资料并行TNM分期，术前均未进行治疗。其中男32例，女4例;年龄22～80岁，中位年龄59岁;肿瘤切除后立即无菌条件下取癌组织、癌旁组织(距癌边缘2 cm)及正常组织(距癌肿边缘5 cm以上)约1.0×0.5×0.5 cm3，-80℃保存备检。

    　　1.2 RTPCR法测定KLF4、KLF6 mRNA表达

    　　Trizol 和GoTaq绿色体系购自美国Promega公司;逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司;KLF4、KLF6及内参照3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的RTPCR特异引物序列均由上海生物工程有限公司提供。组织总RNA提取、逆转录合成cDNA后PCR扩增。引物序列如下：KLF4上游：5′CCATAATTCCTGCCCGAT3′;下游：5′CCAAGCTTCCAAAAGCCTCTTCATGTG3′;KLF6上游5′CGAGCCCTGCTATGTTTC3′;下游:5′ CATCGCCATTTCCCTTGT3′;GAPDH上游：5′ACAGTCCATGCCATCACTGCC3′;下游：5′GCCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。反应体系：GoTaq绿色体系12.5 μl;上、下游引物各2.0 μl;RNA模板2.0 μl;DEPC水6.5 μl。KLF4、KLF6 PCR反应条件：预变性95℃5 min、94℃变性30 s、退火30 s、70℃延伸1 min、共35个循环,最后72℃延伸10 min;KLF4退火温度58℃，KLF6退火温度52℃。取8 μl PCR产物置于1.6%琼脂糖凝胶中，80 V电压电泳30 min，通过凝胶成像系统进行电泳条带扫描，以GAPDH作为内参照物。

    　　1.3 统计学分析

    　　采用SPSS11.5统计软件，两组间显著性检验采用独立样本t检验;三组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，相关分析采用Person法。

    　　2 结 果

    　　2.1 KLF4、KLF6 mRNA在各组织中的表达情况

    　　胃癌组织中KLF4 mRNA的表达明显低于正常组织(P<0.05)，癌旁组织和正常组织表达无显著性差异(P>0.05);KLF6 mRNA在胃癌组织中的表达明显低于正常组织(P<0.05);且癌旁组织中的表达也明显低于正常组织(P<0.05)。见表1，图1、2。M:Marker;T：胃癌组织;P：癌旁组织;N：正常组织图1 KLF4、KLF6 mRNA在胃癌组织、癌旁组织和正常组中的表达表1 胃癌组织、癌旁、正常组织中 KLF4和KLF6 mRNA的表达表2 KLF4和KLF6 mRNA的表达与胃癌　　临床病理特征的关系

    　　2.2 KLF4、KLF6 mRNA的表达与胃癌临床病理学行为的关系

    　　胃癌组织中KLF4 mRNA的表达在淋巴结无转移组明显高于淋巴结转移组(P<0.05);但其表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、Borrmann分型、分化程度、浸润深度，临床分期均无关(P>0.05)。胃癌组织中KLF6 mRNA表达淋巴结无转移组明显高于淋巴结转移组(P<0.01);高分化程度组明显高于中低分化程度组(P<0.05);临床分期中Ⅰ、Ⅱ期明显高于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05);其表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、Borrmann分型、浸润深度均无关(P>0.05)。见表2。

    　　3 讨 论

    　　KLF4主要表达在胃肠道增殖较慢、趋向分化的上皮细胞中。Yang等发现8例结肠癌组织中2例存在KLF4基因杂合型缺失，2例存在过甲基化，而6个细胞系中有5个存在KLF4基因杂合型缺失，2个存在一个或多个位点的点突变〔1〕。Wei等研究发现胃癌组织中KLF4表达与淋巴结转移、肿瘤细胞过甲基化密切相关〔4〕。 本实验研究了KLF4分别在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中的表达，结果显示：KLF4 mRNA在胃癌组织中的表达明显低于正常组织，其表达与淋巴结转移有关;关于其抑癌机制的研究Noti等〔5〕发现KLF4能够招募组蛋白去乙酰化酶到CD11d启动子区，从而抑制该基因的表达，提示KLF4可能通过染色质重塑来抑制基因表达。但其具体作用机制尚待进一步研究。

    　　KLF6是普遍表达的转录因子，通过与启动子GC盒结合激活下游基因的表达。KLF6的功能主要表现为生长抑制，通过P21蛋白的表达来发挥作用〔6〕。本研究结果表明KLF6在胃癌组织中的表达明显低于正常组织，并且癌旁组织中的表达亦明显低于正常组织;其表达与临床分期及淋巴结转移有关。潘修成〔7〕等研究表明原发性肝癌中KLF6基因突变可能不是KLF6基因失活的主要原因，上调P21WAF1表达是KLF6基因抑制肝癌细胞增殖的主要途径。冯洁〔8〕等研究表明KLF6、SP1蛋白在肝癌组织表达率高于癌旁肝硬化组织，正常组织中全部呈阴性表达;癌组织中KLF6的高表达可能是在癌症形成过程中被激活而发生的代偿作用。这与Cho〔9〕等关于KLF6在结肠癌中的报道一致。

    　　总之，KLF4、KLF6是与胃癌发生发展有密切关系的抑癌基因。其具体抑癌的靶点目前研究尚无定论，需要进行体内、体外实验以明确其抑癌作用的具体靶位，为胃癌分子生物治疗提供理论和实验依据。

    　　【参考文献】

    　　1 Zhao W，Hisamuddin IM,Nandan MO,et al.Identification of Kruppellike factor 4 as a potential tumor suppressor gene in colorectal cancer〔J〕. Oncogene，2004;23(2)：395402.

    　　2 Luo A，Kong J，Hu G,et al.Discovery of Ca2+relevant and differentiationassociated genes downregulated in esophageal squamous cell carcinoma using cDNA microarray〔J〕.Oncogene，2004;23(6):12919.

    　　3 Lievre A,Landi B,Cote JF,et al.Absence of mutation in the putative tumorsuppressor gene KLF6 in the colorectal cancers〔J〕.Oncogene，2005;24(48)：72536.

    　　4 Wei D，Gong W，Kanai M,et al.Drastic downregulation of Kruppellike factor 4 expression is critical in human gastric cancer development and progression〔J〕.Cancer Res,2005;65(7)：274654.

    　　5 Noti JD，Johnson AK，Dillon JD,et al.The leukocyte integrin gene CD11d is repressed by gutenriched Kruppellike factor 4 in myeloid cells〔J〕.J Biol Chem，2005;280(5):344957.

    　　6 Cho YG,Kin CT,Park CH，et al.Genetic alterations of the KLF6 gene in gastric cancer〔J〕.Oncogene，2005;24(28):458890.

    　　7 潘修成，陈 智,陈 峰，等.原发性肝癌组织中Kruppel样因子6基因的变异及其抗细胞增殖功能的改变〔J〕.中华肝脏病杂志，2006;14(2):10913.

    　　8 冯 洁，汤正好，臧国庆，等.KLF6、SP1蛋白在肝癌、肝硬化组织中的表达及意义〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2008;17(2):14851.

    　　9 Cho YG，Cho BJ，Song JW,et al.Aberrant expression of kruppellike factor 6 protein in colorectal cancers〔J〕.Word J Gastroenterol，2006;12(14)：22503.