应用组织芯片检测Bmi-1及P16在胆管细胞癌中的表达及意义

肿瘤的发生、发展与细胞周期调控异常有着非常密切的关系，与细胞调控异常相关的基因很多，如Caspase-3、Bcl-2/Bax、P53、Bmi-1、P16等[1-2]。Bmi-1是细胞周期中非常重的调节因子，其可以促进细胞的增殖、分化以及肿瘤细胞的形成[3-4]。而P16属于细胞增殖、分化的负性调节因子，通过与周期蛋白D(Cyclin D)结合为复合物，阻止了细胞从G1期进入S期，抑制细胞的分裂。本研究采用免疫组织化学技术(SP法)检测Bmi-1及P16基因在胆管细胞癌组织中的表达，探讨其与胆管细胞癌的发生、发展之间的关系。

1材料与方法

1.1标本与主要试剂：由桂林泛谱生物技术有限公司构建的人胆管细胞癌芯片共4张，15×10点阵，每点直径1.1 mm，4μm厚，其中包括70例胆管细胞癌组织，5例癌旁组织，双芯布阵。所有标本由临床外科手术所切除的组织标本提供，切除的标本用10%的甲醛固定24～48 h。所获得的胆管细胞癌芯片的患者中，男40例，女30例，年龄22～76，平均56.8岁。有淋巴结转移31例，无淋巴结转移39例。所有病例术前均未实施放疗、化疗。主要试剂：浓缩型兔抗人Bmi-1多克隆抗体、浓缩型鼠抗人P16蛋白多克隆抗体、羊抗兔/鼠生物素化二抗、免疫组织化学试剂盒为超敏即用型S-P通用型、多聚赖氨酸及DAB显色试盒等均由北京中杉生物技术有限公司提供。

1.2检测方法：用免疫组织化学SP法。将已知阳性的胆管细胞癌切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。试验步骤按试剂盒说明书进行。具体步骤为：①组织切片为4μm，二甲苯脱蜡，乙醇脱水;②抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复);③3%过氧化氢滴加，以抑制内源性过氧化物酶活性使用37℃湿盒孵育10 min;④以减少非特异性背景使用正常羊血清37℃湿盒孵育10 min;⑤然后分别滴加一抗;⑥滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物37℃湿盒孵育;⑦滴加新鲜配置的DAB显色液显色;⑧苏木素复染、水洗、1%盐酸酒精分色、水洗、饱和碳酸锂1分钟、水洗;⑨95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检。

1.3结果判定：采用多光谱成像系统(Olympus公司)对Bmi-1及P16蛋白的表达进行定量分析，将每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积)。Bmi-1、P16蛋白是以胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。

1.4统计学方法：染色结果数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0软件对各组反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做t检验。检验水准：α=0.05。

2结果

2.1　Bmi-1的表达：可见胆管细胞癌组织中分布棕黄色颗粒较为密集，主要位于细胞核内，见图1;而癌旁组织中仅可见少量的棕黄色颗粒，至未见，Bmi-1表达弱或无表达，见图2，经图像分析，Bmi-1在胆管细胞癌组织中的平均光密度为0.295 7±0.008 9，而癌旁组织中Bmi-1平均光密度为0.0681±0.001 9;Bmi-1在胆管细胞癌组织中阳性面积率为0.2873±0.0087，癌旁组织中Bmi-1的阳性面积率为0.066 4±0.001 8。经统计学分析胆管细胞癌组与癌旁组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2　P16蛋白的表达：在显微镜下观察可见胆管细胞癌组织中有少量的棕黄色颗粒，有些胆管上皮中甚至未见棕黄色的阳性颗粒，P16蛋白表达弱或无表达，见图3;而癌旁组织中在显微镜下观察时细胞内分布着一些密集而且染色较深的棕黄色颗粒，P16蛋白呈阳性，主要位于细胞核内，见图4。经图像分析，P16蛋白在胆管细胞癌组织中的平均光密度为0.058 9±0.001 6，而癌旁组织中平均光密度为0.257 1±0.008 4;P16蛋白在胆管细胞癌组织中阳性面积率为0.058 0±0.001 7，癌旁组织中P16蛋白的阳性面积率为0.284 3±0.008 8。经统计学分析胆管细胞癌组与癌旁组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3讨论

胆管细胞癌属于原发性肝癌，指发生于二级胆管以上的胆管上皮肿瘤，多见于男性。在我国，原发性肝癌中占约5%，近年来发病率逐年上升[5]。临床症状多不明显，周围型胆管癌早期无症状，晚期可有上腹不适、肝大、体重下降等;肝门型胆管细胞癌常以黄疸为初发症状。一般发现多为晚期，手术切除率低，预后极差。随着分子医学的发展，以期通过选择性抑制等方法来防治胆管细胞癌。Bmi-1基因属于PcG(polycomb group gene，多梳基因)，其蛋白是重要的抑制转录因子之一，其可促进细胞增长，减少细胞凋亡。研究表明，PcG通过对细胞周期的调节，在肿瘤的发生、发展中有着重要的作用[6-8]。Bmi-1蛋白在细胞核与染色质结合，抑制INK4a-ARF，调低INK4a-p16和ARF-P19产生，降低INK4a-p16对cyclinD-CDK4的抑制作用，促进细胞从G1期向S期转换，加速细胞的生长;同时因降低P19-ARF产生，增加P53降解，减少细胞的凋亡[6]。P16基因属于抑癌基因，其蛋白通过与CDK4(细胞周期蛋白依赖激酶)竞争性结合cyclin D1(细胞周期素D1)，从而阻止了细胞的增殖作用。研究表明，在一些肿瘤中，P16基因突变或者缺失[9-10]。本研究中，通过免疫免疫组织化学方法在胆管细胞癌及癌旁组织芯片同时检测Bmi-1及p16的表达情况，结果表明Bmi-1在胆管细胞癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达，甚至不表达，两者之间差异有明显的统计学意义(P<0.05);P16在胆管细胞癌组织中低表达，而癌旁中高表达，两者在统计学上有明显差异性。同时发现，Bmi-1在胆管细胞癌组织中呈高表达，而P16蛋白在胆管细胞癌组织中呈低表达，且Bmi-1与P16蛋白的表达呈现负相关，由此推测Bmi-1可能通过对P16蛋白表达的负性调控，进而使细胞凋亡机制失常，引起细胞的异常增殖，但Bmi-1如何调节p16的表达，以及p16如何调节胆管细胞癌的发生发展，尚需在细胞水平进一步研究。

4参考文献

[1]Moser HW.Adrenoleukodystrophy：natural history，treatmentand outcome[J].J Inher Metab Dis，1995，18(4)：435

[2]梁秀龄.神经病学-神经系统遗传性疾病[M].北京：人民军医出版社，2001：306.

[3]Dorothea D，Jessie H，Long H，et al.Bmi-1 promotes E-wing sarcoma tumorigenicity independent of CDKN2A repression[J].Cancer Res，2008，68：6507.

[4]Sonal D，Mark JH，Prashant B，et al.Bmi-1 cooperateswith H-Ras to transform human mammary epithelial cells viadysregulation of multiple growth-regulatory pathways[J].CancerRes，2007，67：10286.

[5]Davila JA，ElSerag HB，Cholangiocarcinoma：The“other”liver cancer on the rise[J].Am J Gast roenterol，2002，97(12)：3199.

[6]Jan W，Dieter S，Louise A，et al.Chromatin-association ofthe polycomb group protein Bmi-1 is cell cycle-regulated andcorrelates with its phosphorylation status[J].J Cell Science，1999，112：4627.

[7]Reinisch CM，Uthman A，Erovic BM，et al.Expression ofBmi-1 in normal skin and inflammatory and neoplastic skin lesions[J].J Cutan Pathol，2007，34(2)：174.

[8]黄虎，栗娜，胡义德.Bmi-1、cyclin D1、p16在胃癌中的表达及意义[J].重庆医学，2009，38(5)：569.

[9]Kanb A，Gruis NA，Weaver-Feldhans J，et al.Acen cycleregulater potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science，1994，264：2336.

[10]Igaki H，Sasaki H.Mutation frequency of the P16/cdkn2gene in primary cancer in the upper digestive tract[J].CancerRes，1995，55(15)：3421.