酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测特异性IgE抗体的对比分析

　　作者：蔡秀玲1,吴善东2,刘奕2　　作者单位：1.中国医学科学院皮肤病医院检验科，江苏 南京 210042;2.浙江大学过敏研究中心，浙江 杭州 310016

　　【摘要】目的：比较酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测特异性IgE抗体结果的一致性。方法：收集门诊就诊的过敏性皮肤病49例患者血清，用两种不同的实验方法对特异性IgE抗体进行测试，分析和比较两种不同方法所得结果。结果：两种方法的平均吻合度为94.2%，Kappa系数为0.71。结论：ELISA法检测sIgE抗体与敏筛法比较，吻合度较好，结果具有较高的符合率，可用于临床sIgE抗体的检测。

　　【关键词】 酶联免疫吸附试验;免疫印迹法;特异性IgE抗体;一致性比较

　　世界变态反应组织(WAO)对30多个国家进行的调查显示，近22%的人患有IgE介导的变态反应性疾病，如变应性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏等[1]。变态反应性疾病已经成为一种常见病，其病因复杂，病程呈慢性反复发作，临床上常找不到明确病因。因此，明确变应原对变态反应病的诊断和治疗至关重要。我们使用德国敏筛系统(免疫印迹法)检测患者血清中特异性IgE抗体(sIgE抗体)已近10年，敏筛法作为一种成熟(阳性范围的CV在2%～8%，稀释线性好，r=0.9735)[2]的方法为临床诊断提供了很有价值的参考。本研究旨在探讨浙大迪迅酶联免疫吸附试验法与德国敏筛法检测结果的一致性，分析其临床应用价值。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床资料

　　收集2010年11月至2011年5月来中国医学科学院皮肤病医院就诊的皮肤病(荨麻疹、湿疹，异位性皮炎等)患者49例，男性25例，女性24例，年龄1～68岁，平均23.2岁。分别采用德国敏筛系统和浙大迪迅酶联免疫吸附试验法对选取的患者血清进行sIgE抗体检测(血清-20℃冻存，用前复融)。

　　1.2　仪器和试剂

　　敏筛系统、CCD照相及试剂都由德国MEDIWISS公司提供;ELISA法所用酶标仪为Bio-RAD Model 550，试剂为浙大迪迅公司提供。

　　1.3　测定方法

　　1.3.1　敏筛系统

　　首先加入患者血清，与吸附于硝酸纤维素膜表面的特异性过敏原反应，经孵育和洗涤，再加入生物素标记的IgE抗体，然后加入结合了碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和BCIP/NBT底物显色剂，然后通过光密度测定进行量化，采用CCD相机成像进行测定。

　　1.3.2　酶联免疫吸附试验

　　采用浙大迪迅试剂盒(ELISA)，将固化于载体表面的过敏原与患者血清一起孵育、洗涤，再加上辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体和TMB底物显色剂，通过酶标仪在450 nm处测出D值，根据标准曲线计算出IgE浓度。

　　1.3.3　判断标准

　　所有的样本严格按照操作规程进行操作，两者结果根据sIgE浓度分为<3.5 kU/L为阴性，≥3.5 kU/L为阳性。

　　1.4　统计学方法

　　以SAS8.0软件进行统计学分析，以敏筛法作为参考法，将ELISA法与其进行一致性检验，Kappa>0.6表示高度一致[3]。

　　2　结　果

　　两种检测方法各项结果。以敏筛法作为参照，评价ELISA法和敏筛法测定结果的相关性。两种方法共检测882项，检测结果完全一致的为831项，即符合率为94.2%。检测结果不一致的为51项，比例为5.8%。一致性检验结果显示Kappa系数为0.71，说明两种方法有较高的一致性。两试验吻合度范围从83.7%(户尘螨)～98.0%(牛奶、牛肉、猫毛皮屑)。　敏筛法及ELISA法检测sIgE　敏筛法和ELISA法对sIgE进行平行检测的吻合度对比

　　3　讨　论

　　本次研究中，ELISA法和德国敏筛法检测所得结果的一致性较好，总的符合率为94.2%，Kappa系数达到0.71;各项过敏原检测的吻合度都较好，范围从83.7%(户尘螨)～98.0%(牛奶、牛肉、猫毛皮屑)。因为主要是了解两种方法的一致性，故未对临床资料和试验结果进行分析。本次对比样本量不是很理想，如果条件允许的话，应该加大研究的样本量，使得结果可信度更高。

　　现代变态反应学的观点认为，完整的过敏原特异性诊断应包括病史、体内试验、体外试验三部分。其中体内测试有可能引发潜在的全身性过敏性反应，而且结果易受患者皮肤条件、服药史、操作者的操作手法等影响;而体外试验安全性好，所以体外检测IgE变得尤其重要[4]。国外有许多种体外测定特异性IgE抗体的方法，如最早的放射变应原吸附试验(RAST)，目前常用的是荧光酶免疫分析法(FEIA)以及斑点免疫印迹法(dot-IBT)等等。基于dot-IBT原理的AllergyScreen系统，检测血清中特异性过敏原，结果可靠，方便快速，作为一种成熟的方法为临床诊断变态反应性疾病提供了很有价值的参考[5]，但此法对总IgE只能作半定量的检测。而浙大迪迅酶联免疫吸附法作为国内首家开发的过敏原体外检测系统，不但可以定量检测特异性IgE，还可以定量测总IgE，填补了国内空白。在我国这样一个幅员辽阔，各地区变应原分布差异大的国家，此法的多种不同组合，适应了各个地区的不同需要。临床可根据不同需求选择变应原，从而降低患者的成本。

　　【参考文献】

　　[ 1 ]　Warner JO， Kaliner MA， Crisci CD， et al. Allergy practice worldwide： a report by the World Allergy Organization Specialty and Training Council[J]. Int Arch Allergy Immunol,2006,139(2)：166-174.

　　[ 2 ]　Herzum I， Blmer N， Kersten W，et al. Diagnostic and analytical performance of a screening panel for allergy [J].Clin Chem Lab Med， 2005， 43(9)： 963-966.

　　[ 3 ]　Landis JR，Koch GG. The measurement of observer agreement for categorical data[J]. Biometrics,1977,33(1)：159-174.

　　[ 4 ]　AAAI.The use of vitro tests of IgE antibody in the specific diagnosis of IgE-mediated disorders and in the formulation of allergen immunotherapy[J].J Allergy Clin Immunol， 1992， 90(2)： 263-267.

　　[ 5 ]　蔡秀玲，仇宁，冯素英，等. 南京地区1105例变应性皮肤病患者血清过敏原特异性IgE抗体检测 [J].国际皮肤性病学杂志，2009， 35(3)： 135-136.