三氧化二砷体外抑制A375黑色素瘤细胞的生长及谷胱甘肽过氧化物酶的活力
发表时间：2010-03-22 浏览次数：703次
作者：应方微,唐松,刘桂琴 作者单位：518040）中国广东省深圳市眼科医院
【摘要】 目的：了解三氧化二砷(As2O3)对体外培养的A375黑色素瘤细胞的生长及谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法检测1.5，3.0，6.0，12.0，24.0μmol/L As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24，48，72h后对瘤细胞的抑制作用；测定共培养24h的A375黑色素瘤细胞所含的谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果：各浓度As2O3对A375瘤细胞的生长均有明显的抑制作用， As2O3的浓度越高，增殖抑制作用越强；各浓度As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24h后，瘤细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力均有明显的降低，分别为2.23±0.81，2.87±0.70，4.08±0.81，2.63±0.84，1.40±0.41mU/mL，在As2O3浓度为6.0μmol/L时，酶活性最高，低于此浓度或高于此浓度时，酶活力呈递减的趋势。经过统计学独立样本的t检验分析，差别有统计学意义。结论：As2O3对A375瘤细胞的生长有浓度依赖性抑制作用，As2O3显著降低A375瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力。
【关键词】 三氧化二砷；A375黑色素瘤细胞；四甲基偶氮唑蓝；谷胱甘肽过氧化物酶
Inhibition effect of arsenic trioxide on the A375 melanoma cell growth and glutathione peroxidase activity in vitroFangWei Ying, Song Tang, GuiQin LiuShenzhen Eye Hospital, Shenzhen 518040, Guangdong Province, ChinaAbstractAIM: To understand the effect of arsenic trioxide (As2O3) on cultured A375 melanoma cell growth and glutathione peroxidase activity.METHODS: Using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction to assay the inhibition effect of 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0μmol/L As2O3 on A375 melanoma cells for 24, 48, 72 hours, respectively. To determine the glutathione peroxidase activity of the A375 melanoma cells cocultivated with As2O3 for 24 hours. RESULTS: The growth o A375 tumor cells were inhibited by dosedepending As2O3 significantly. The higher As2O3 concentration was, the lower A375 cells proliferation was. 24 hours later, the glutathione peroxidase activity of the A375 cells was 2.23±0.81，2.87±0.70，4.08±0.81，2.63±0.84，1.40±0.41mU/mL respectively, and the 6.0μmol/L As2O3 had the highest activity. Below or above this concentration, the enzyme activity showed decreasing trend. After statistically independent samples ttests analysis, the difference was statistically significant.CONCLUSION: As2O3 can inhibit the growth of A375 tumor cells in a dosedependent manner and can reduce the A375 tumor cell glutathione peroxidase activity significantly. KEYWORDS: arsenic trioxide; A375 melanoma cells; methyl thiazolyl tetrazolium ; glutathione peroxidase引言
眼睑皮肤恶性黑色素瘤是眼科比较常见的恶性肿瘤，三氧化二砷(As2O3)对实体肿瘤有一定的治疗作用，在体外诱导肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠黑素瘤生长，但其作用机制不十分明确[1]，我们用不同浓度As2O3 对体外培养的A375黑色素瘤细胞生长，肿瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响，探讨As2O3 杀伤A375黑色素瘤细胞的机制，现报告如下。
1材料和方法
1.1材料
As2O3（sigma），A375黑色素瘤细胞株（中国科学院上海细胞生物研究所），RPMI1640培养基（GIBCO）,胎牛血清（杭州四季青），酶标仪（THAM）,谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（碧云天）。
1.2方法
以RPMI1640完全培养液培养A375瘤细胞株，置于37℃，50mL/L CO2培养，定期换液，传代，充分扩增细胞。设立As2O3终浓度分别为0,1.5,3.0,6.0,12.0,24.0μmol/L，在96孔细胞培养板上，每小组7孔，各加入2×105/mL的瘤细胞悬液200μL，将培养板置于37℃，50mL/L CO2培养箱分别培养24，48，72h。
1.2.1瘤细胞杀伤的测定
与 As2O3共培养24,48,72h的A375瘤细胞，每孔加入5g/L MTT液20μL，继续培养4h后吸除培养液，各加入二甲基亚砜200μL，充分混匀。在酶标仪上测定各组在波长492nm的吸光度A值，根据公式：细胞相对生长抑制率=1(实验组A值/对照组A值)×100％，计算各组A375瘤细胞的生长抑制率。表1As2O3对A375瘤细胞的生长的抑制的A340值和生长抑制率（略）
1.2.2谷胱苷肽过氧化物酶活性的测定
与As2O3共培养24h的A375瘤细胞，用细胞刮取下，加入PBS混悬后计数细胞，1000g离心5min，去上清，重复一次后，加入细胞裂解液成1×1014/L充分混匀，冰浴匀浆后4℃，12000g离心10min，取上清用于酶活性测定。设定空白对照（无样品）和样品本底对照（无过氧化物试剂溶液），取上述的样品上清4μL,GPx检测液10μL分别加入到182μL的谷胱苷肽过氧化物酶检测缓冲液中混匀，加入15mmol/L过氧化物试剂溶液4μL后及开始用酶标仪在25℃检测波长340nm的吸光度A340值，每隔30s检测1次，连续检测6个数据。根据公式：谷胱甘肽过氧化物酶活力（mU/mL）=[A340(样品)/minA340(空白)/min]/0.00622。 统计学分析：利用SPSS 13.0统计软件的独立样本t检验分析As2O3对A375瘤细胞的谷胱苷肽过氧化物酶活性的影响,以P＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1 As2O3对A375瘤细胞生长的抑制作用
A375黑色素瘤细胞贴壁生长，核圆形或长椭圆形，不同浓度的As2O3与A375瘤细胞共培养24，48，72h后，与对照组相比，各浓度的As2O3对A375瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用， As2O3的浓度越高，对培养的A375瘤细胞的增殖抑制作用越强，其中1.5μmol/L As2O3作用72h对A375瘤细胞的生长无抑制（表1）。
2.2谷胱甘肽过氧化物酶活性
各浓度As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24h后，A375黑色素瘤细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力与对照组相比，均有明显的降低，在As2O3浓度为6.0μmol/L时， A375瘤细胞的酶活性相对最高，低于此浓度或高于此浓度时，酶活力呈递减的趋势（图1）。
3讨论 细胞内活性氧自由基(ROS)是细胞线粒体内氧化还原代谢的产物，参与细胞内的信号转导，与细胞生长凋亡有密切关系。大量研究表明，ROS可介导细胞信号转导，激活转录因子，促使基因表达，调控细胞生长、增殖和凋亡，发挥重要生物学效应。当细胞内ROS的生成和清除失衡及定位出现异常时，则会损伤组织细胞，甚至导致细胞的死亡。谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。它能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。As2O3是一种具有抗肿瘤作用的药物，目前已用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病。As2O3诱导实体肿瘤细胞凋亡与细胞内ROS的水平改变有关[2，3]。As2O3 作为细胞毒性药物，它通过蛋白质的巯基结合，干扰细胞代谢，诱导肿瘤凋亡[4]。As2O3可直接与巯基形成复合物As(GS)，从而阻断由GPx作用下的H2O2还原为H2O的过程，降低其清除ROS的能力，间接地使ROS水平升高。结果提示，不同浓度的As2O3 均明显降低了体外培养A375黑色素瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力，从而影响肿瘤细胞内ROS的清除，使得细胞内ROS含量上升，引起细胞损害及死亡。但是根据不同的As2O3浓度，谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的水平又有所波动，在6.0μmol/L As2O3浓度下形成了谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的小高峰，高于及低于此浓度，酶活力均呈现递减的趋势，这与实验中MTT法检测的肿瘤细胞体外杀伤A375黑色素瘤的结果并不完全吻合。体外杀伤实验显示，As2O3 体外杀伤A375黑色素瘤细胞呈现浓度依赖性，24h的作用下，As2O3 浓度越高，肿瘤细胞生长的抑制率越高，24μmol/L As2O3 时肿瘤细胞生长抑制率达到74.4%，随着浓度递减，生长抑制率逐渐递减，1.5μmol/L As2O3时生长抑制率至17.6%，由此可见As2O3 体外抑制A375黑色素瘤生长的作用机制很复杂，对谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的抑制只是其中一个方面。
【参考文献】 1夏俊，陈俊霞，于丽华,等．三氧化二砷抑制小鼠B16黑色素瘤生长作用及其机制.中国药理学通报 2004；20(9)：10541058
2 Jing Y，Dai J, Chimers Rechmn RM, et al. Arsenic trioxide selectivelv induces acute promyelocytic leukemia cell apoptosis via a hydrogeperoxide dependent pathway. Blood 1999；94(6)：21022111
3曹娟，郑杰．As203诱导肿瘤细胞凋亡依赖H202途径.中国病理生理杂志 2006;22(6)：11851190
4 Nicoletti I，Migliorati G，Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thyolocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods 1991;139(2)：271279
