烟焦油对体外人视网膜色素上皮细胞的损害

　　作者：胡媛媛,杨玲玲,宫华青　　作者单位： (266071)中国山东省青岛市，山东省眼科研究所 山东省眼科学重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地

　　【摘要】目的:研究烟焦油对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium，HRPE)超微形态结构的影响，以及趋化因子MCP1的细胞外表达水平。方法:将体外培养的HRPE分为空白对照组、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)对照组和焦油实验组,其中焦油实验组中焦油浓度分别为1，10，50mg/L，经48h培养后，与空白对照组及DMSO对照组进行比较，使用倒置显微镜及透射型电子显微镜观察HRPE的形态以及超微结构变化，并用ELISA法选择检测各组培养上清中细胞因子MCP1的表达量。结果:倒置显微镜显示焦油实验组随着焦油浓度的增大，发生变性坏死的HRPE细胞数量逐渐增多，并且细胞的形态发生明显改变;电镜显示焦油实验组随着焦油浓度的增大，RPE细胞形态扁平，微绒毛减少，胞质稀疏、减少，细胞核细长、核染色质稀疏，染色质浓缩，可见空泡，细胞呈萎缩状态;ELISA结果显示随着焦油浓度的增大，RPE分泌至胞外的MCP1逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论:烟焦油可改变视网膜色素上皮细胞正常的形态和生理功能，造成色素上皮细胞的严重损害。

　　【关键词】 吸烟;烟焦油;年龄相关性黄斑变性;视网膜色素上皮细胞;MCP1

　　Damage of cigarette tar on human retinal pigment epithelium in vitro

　　YuanYuan Hu, LingLing Yang, HuaQing Gong

　　Foundation item:Shandong Provincial Medical Scientific Academy Science and Technology Rroject(No.200637)

　　State Key Lab Cultivation Base, Shandong Provincial Key Lab of Ophthalmology, Shandong Eye Institute, Qingdao 266071, Shandong Province,China

　　Abstract

　　　AIM: To investigate the effect of cigarette tar on the ultrastructure and the expression of monocyte chemotactic protein1 (MCP1) in human retinal pigment epithelium(HRPE) in vitro.

　　 METHODS: The cultured HRPE were divided into blank group, DMSO group and cigarette tar experimental group. The concentrations of tar in cigarette tar experimental group were 1，10，50mg/L. After HRPE were treated with cigarette tar for 48h, the cellular morphology of HRPE was observed by inverted microscope and their ultrastructure was analyzed by transmission electron microscope, while ELISA kit is used to determine the levels of MCP1 in the supernatants in the three groups.

　　　RESULTS: The quantity of HRPE, which degenerated or necrosed in cigarette tar experimental group, increased with the rising of tars concentration in inverted microscope. The transmission electron microscope showed that HRPE became flat in morphous with reduced microvilli, their cytoplasm were rarities and diminished while their cellular nucleus became slender, with rarities and psychotics chromatin. And the expression of MCP1 in the supernatants was reduced significantly with the rising of tar’s concentration(P<0.05).

　　　CONCLUSION: Cigarette tar can change HRPE’s normal morphous and physiological function，and it can cause HRPE serious damage. Smoking may damage retinal by affecting retinal pigment epithelium.

　　　KEYWORDS: smoking; cigarette tar; agerelated macular degeneration; retinal pigment epithelium; monocyte chemoattractant protein1

　　0引言

　　年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration，AMD)是目前西方发达国家中老年人群首要的致盲性眼病,而且随着人口老龄化的加剧,其发病率亦随之逐年上升[1,2]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)对维持视网膜的正常功能具有重要意义,其与许多视网膜病理改变相关,研究表明其在AMD的发病机制中具有重要的作用[3,4]。AMD早期临床表现包括RPE细胞的色素异常，RPE细胞基底部有玻璃膜疣(Drusen)形成，导致其上和邻近RPE细胞结构和功能失常，或引起脉络膜血管增生，最后引起相应部位的视细胞功能丧失。当病变发生在黄斑中心部时，患者中心视力严重受损，甚至失明[5]。流行病学研究表明，AMD是多基因和环境危险因素共同作用而导致的疾病[6,7]。吸烟可增加AMD的患病率,其危险度在1.20～3.29之间[8]。吸烟在AMD中发挥作用的阶段并不局限于加重脉络膜血管新生，而可能是在更早阶段，比如通过影响RPE细胞的功能发挥作用[9]。由于引起AMD的致病因子和具体的发病机制尚不明了，吸烟在AMD发生发展中的作用机制也不得而知。我们探讨烟焦油对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium，HRPE)的结构和功能的影响，揭示吸烟对视网膜的损害，为阐明吸烟对AMD的发生、发展提供理论依据。

　　1材料和方法

　　1.1材料 ARPE19(ATCC公司)，T.P.M.(山东中烟工业公司青岛所检测站馈赠),DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，细胞培养箱BB 5060(Heraeus公司)，超净台(苏州净化)，相差倒置显微镜Olympus IMT2(Nikon公司)，MCP1 ELISA用抗体(BD公司)。

　　1.2方法 取HRPE细胞，传代接种于6孔板，细胞密度为 2×105个/孔，置于50mL/L CO2,37℃空气培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%，弃原培养液后，将6孔分为空白对照组、DMSO阳性对照组和焦油实验组。空白对照组中加入1mL含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养，由于T.P.M.不溶于水而溶于万能溶媒DMSO,故将T.P.M.溶于DMSO,并设DMSO阳性为对照组， DMSO对照组加入1mL含10μL DMSO(为最大浓度焦油组中DMSO的浓度)的培养液，实验组中加入不同浓度的T.P.M./DMSO溶液,加培养液至1mL,其中焦油浓度分别为1，10，50mg/L，经48h培养后，使用倒置显微镜观察并照相，收集各组细胞上清，12000r离心15min，取上清液保存于20℃备ELISA用,并收集各组细胞进行透射电子显微镜分析。将各组HRPE细胞移去上清后，PBS冲洗3遍，40mL/L戊二醛二甲胂缓冲液前固定1h,0.22mol/L蔗糖添加二甲胂缓冲液过夜，10mL/L锇酸巴比妥醋酸缓冲液后固定1h，乙醇梯度脱水，待第3次无水乙醇时用细胞刮棒小心将细胞从6孔板上刮下，1000r离心2min，600mL/L环氧树脂氧化丙烯浸透、环氧树脂包埋，切取超薄切片置于铜网上行醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，应用JEM1200透射型电子显微镜分析样本。ELISA检测按照BD公司人MCP1试剂盒提供的步骤测HRPE上清液中MCP1的浓度，并使用SoftMax Pro 4.8分析软件对结果进行分析。

　　统计学分析：各组数据均采用均数±标准差(±s)表示，数据使用SPSS 13.0 for windows采用单因素方差分析进行检验，LSD法进行多重比较，P<0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　2.1 HRPE细胞倒置显微镜照相 空白对照组、DMSO对照组及1mg/L焦油组细胞形态正常，以细梭状为主。焦油实验组随着焦油浓度的增大，发生变性坏死细胞数量逐渐增多、并且细胞的形态发生改变，细胞趋于脱壁。

　　2.2 HRPE细胞超微形态结构变化 透射型电子显微镜显示正常空白对照组和DMSO对照组的HRPE细胞形态正常，微绒毛丰富，核质比例适中，核仁清晰可见;焦油实验组随着焦油浓度的增大，HRPE细胞形态扁平，微绒毛减少，胞质稀疏、减少，细胞核细长、核染色质稀疏，染色质浓缩，可见空泡，细胞呈萎缩状态。

　　2.3 MCP1的表达 单因素的方差分析结果表明，各组间RPE细胞分泌MCP1差异有统计学意义(P<0.05，F =171.262)，LSD方法两两比较结果可见空白对照组、DMSO对照组与1,10,50mg/L焦油组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

　　3讨论

　　烟焦油对HRPE细胞形态以及超微结构的影响。RPE细胞是单层柱状色素上皮细胞，其位于感觉神经性视网膜和Bruch膜之间，是血视网膜屏障的一部分，负责感光细胞外节的吞噬，限制视网膜由于蓝光或活性氧介导的氧化损伤，并且对视网膜营养物质和代谢产物的交换具有重要的作用[10]。尽管AMD表现有不同的临床特征，但在其早期经常出现RPE细胞的退行性变。早期的AMD病理改变包括异常的RPE细胞形态改变和色素沉着，RPE细胞异常的脂褐质沉着和在RPE细胞及Bruch’s膜之间玻璃体疣的形成等[11]。本研究显示,随着培养基中焦油浓度的增大，发生变性坏死的HRPE细胞数量逐渐增多、并且细胞的形态发生改变，细胞趋于脱壁，透射电镜显示,RPE细胞超微结构发生改变，细胞组织呈萎缩状态，细胞趋于凋亡,以上结果均表明焦油对RPE细胞具有毒性作用，能使其失去正常的形态结构，这必将影响其血视网膜屏障作用、抗氧化损伤的能力以及营养物质和代谢产物的交换等功能，最终影响视网膜的形态和功能，造成视网膜的损害。烟焦油对HRPE细胞分泌趋化因子MCP1的影响。单核细胞趋化蛋白1 ( monocyte chemotactic protein1, MCP1)又称单核细胞趋化和激活因子，属CC亚族成员，其能够特异性地趋化单核细胞和淋巴细胞，使单核细胞聚集到病变部位发挥组织修复与重建的重要作用[12,13]。有研究表明,在正常人的玻璃体中有MCP1的表达(500～1200ng/L),这表明在正常健康状态下，视网膜有MCP1的表达[14,15]，这与我们的空白对照组以及DMSO对照组中HRPE细胞表达及分泌MCP1相符。Momma等[16]用人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染人RPE细胞，来评价HCMV对HRPE细胞分泌细胞因子以及对细胞因子基因表达的影响，结果显示HCMV感染的HRPE的MCP1表达产物进行性下降，HCMV感染的HRPE的MCP1 mRNA 稳态水平也显著地下降，这些均说明HCMV感染抑制RPE细胞MCP1基因的转录。细胞外环境MCP1表达量的减少可能有阻止粒细胞迁移至感染部位的作用，因而帮助病毒逃脱宿主细胞的免疫系统，并在视网膜中建立一个潜在的感染。Nordskog 等[17]通过人内皮细胞和单核细胞动态分析香烟冷凝液对细胞因子的影响，结果观察到了主动脉内皮细胞的促炎症反应和单核细胞系的免疫抑制反应，香烟冷凝液处理组内皮细胞的MCP1持续显著地低于对照组[18]。Shena等[19]向CCL2/MCP1缺陷鼠视网膜下注射基质胶，结果成功诱导出其视网膜退行性变和视网膜新生血管的形成，并认为这一模型可用来研究AMD的发病机制。我们的研究表明,随着焦油浓度的逐渐增大,HRPE细胞MCP1表达产物进行性下降，焦油可使HRPE细胞分泌MCP1减少，MCP1减少将使粒细胞的趋化能力减弱，结果将影响视网膜下沉积物的清除以及损伤的修复，从而造成视网膜的损害。流行病学研究显示，吸烟是AMD单个最危险的环境因素[20,21]，烟焦油成分通过循环进入脉络膜，经物理扩散或主动运输穿过血管壁、组织间质、Bruch膜后作用于RPE细胞，使RPE细胞失去正常形态结构和功能，造成视网膜的损害，引起视网膜的退行性变，从而推进AMD的发生与进展。由于引起AMD的致病因子和具体的发病机制尚不明了，吸烟在AMD发病机制中可能的作用机制还有待于进一步的研究。

　　A:空白对照组;B:10mL/L DMSO对照组;C:1mg/L焦油组;D:10mg/L焦油组;E:50mg/L焦油组

　   A:空白对照组细胞正常;B:DMSO对照组细胞正常;C:1mg/L焦油组细胞正常;D:10mg/L焦油组细胞形态扁平，微绒毛减少，胞质稀疏，细胞核细长、核染色质稀疏;E:50mg/L焦油组细胞扁平，微绒毛凌乱稀少，细胞浓缩，胞质减少，染色质浓缩，可见空泡形成

　　【参考文献】

　　1 Friedman DS,OColmain BJ,Munoz B, et al. Prevalence of agerelated macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol2004;122(4):564572

　　2 Klein R，Peto T，Bird A, et al. The epidemiology of agerelated macular degeneration. Am J Ophthalmol2004;137(3):486 495

　　3 Fine SL，Berger JW， Maguire MG, et al. Agerelated macular degeneration. N Engl J Med2000;342(7):483 492

　　4 De S，Rabin DM， Salero E, et al. Human retinal pigment epithelium cell changes and expression of alphaBcrystallin: A biomarker for retinal pigment epithelium cell change in agerelated macular degeneration. Arch Ophthalmol2007;125(5):641645

　　5 Tuo J, Bojanowski CM, Chan CC. Genetic factors of agerelated macular degeneration. Prog Retin Eye Res2004;23(2):229249

　　6 Tomany SC,Wang JJ,Van Leeuwen R, et al. Risk factors for incident agerelated macular degeneration:pooled findings from 3 continents. Ophthalmology2004;111(7):12801287

　　7 Yan Y, Wang L. Recent advance of the study on pathogenesis of agerelated macular degeneration. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi)2008;8(9):18881890

　　8 Solberg Y, Rosner M, Belkin M. The association between cigarrette smoking and ocular disease. Surv Ophthalmol1998;42(6):535547

　　9 Thornton J, Edwards R, Mitchell P, et al. Smoking and agerelated macular degeneration: a review of association. Eye2005;19(9):935944

　　10 Strauss O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev2005;85(3):845881

　　11 Feher J, Kovacs I, Artico M, et al. Mitochondrial alterations of retinal pigment epithelium in agerelated macular degeneration. Neurobiol Aging2006;27(7):983993

　　12 Rollins BJ, Walz A, Baggioling M. Recombinant human MCP 1/JE induces chemotoxic,calcium flux,and the respiratory burst in human monocytes. Blood1991;78(4):11121116

　　13 Han QH, Hui YN, Du HJ, et al. Migration of retinal pigment epithelial cells in vitro modulated by monocyte chemotactic factorl:enhancement and inhibition. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol2001;239(7):531538

　　14 Mitamura Y, Takeuchi S, Matsuda A, et al. Monocyte chemotactic protein1 in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmologica2001;215(6):415 418

　　15 Elner SG, Elner VM, Jaffe GJ, et al. Cytokines in proliferative diabetic retinopathy and proliferative vitreoretinopathy. Curr Eye Res1995;14(11):10451053

　　16 Momma Y, Nagineni CN, Chin MS, et al. Differential expression of chemokines by human retinal pigment epithelial cells infected with cytomegalovirus. Invest Ophthalmol Vis Sci2003;44(5):20262033

　　17 Nordskog BK, Fields WR, Hellmann GM. Kinetic analysis of cytokine response to cigarette smoke condensate by human endothelial and monocytic cells. Toxicology2005;212(23):8797

　　18 Gu L, Okada Y, Clinton SK, et al. Absence of monocyte chemoattractant protein1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor deficient mice. Mol Cell1998;2(2):275281

　　19 Shena D, Wenb R,Tuoa J, et al. Exacerbation of retinal degeneration and choroidal neovascularization induced by subretinal injection of Matrigel in CCL2/MCP1deficient mice. Ophthalmic Res2006;38(2):7173

　　20 Evans JR. Risk factors for agerelated macular degeneration. Prog Retin Eye Res2001;20(2):227253

　　21 Klein R, Knudtson MD, Cruickshanks KJ, et al. Further observations on the association between smoking and the longterm incidence and progression of agerelated macular degeneration: the Beaver Dam Eye Study. Arch Ophthalmol2008;126(1):115121