兔视网膜光凝术后组织形态学改变的动态观察

　　作者：覃冬菊　　作者单位：201300)中国上海市南汇区中心医院眼科

　　【摘要】研究532nm激光TsoⅢ级光斑光凝色素家兔视网膜后光凝斑组织形态改变的病理特征。方法：(1)18只色素家兔按光凝后观察时间1，3，7，14，21d及28d分为6组，每组3只。每只(双眼)用532nm激光TsoⅢ级光斑光凝色素家兔视网膜后极部30点532nm,450mW,100μm,0.05s)。(2)光凝后不同观察时间点行荧光素眼底血管造影(fluorescence fundus angiography，FFA)观察光凝斑FFA特点;取光凝区眼球壁制作标本,进行光镜和透射电镜观察并定量分析视网膜光凝斑大小、视网膜细胞存活率的动态变化。结果：(1) 荧光血管造影：光凝后3d，部分光凝斑为高荧光，荧光渗漏随时间延长逐步减轻，至光凝后14d，荧光渗漏基本消失。(2) 组织病理学检查：光凝斑区域视网膜各层组织细胞结构破坏;光凝斑周围光感受器细胞的凋亡或坏死和神经节细胞的损伤;继后色素上皮细胞、Müller细胞和成纤维细胞增生修复破坏区。(3)形态学定量指标：光凝后第1d视网膜光凝斑直径最大为116.4±9.6μm,比参照光斑(75μm)增大了55.2%，随后有下降的趋势，21d后为82.8±5.4μm趋于稳定。视网膜细胞存活率光凝后第1d最小为(29.5±4.2)%，随后有上升的趋势，21d为(48.2±4.4)%趋于稳定。结论： 视网膜光凝TsoⅢ级光斑会导致光凝斑周围视网膜感觉神经细胞的非选择性、扩展性损伤。

　　【关键词】 光凝固术 激光损伤 动物实验 兔 视网膜

　　0引言

　　视网膜光凝术是治疗眼底疾病的一种重要有效的手段，但临床研究发现部分患者术后可出现即刻或进展性视力下降，但其发生发展的机制不太清楚。为探讨激光视网膜损伤的发生发展机制，本研究用532nm激光以TsoⅢ级光斑[1]光凝色素家兔视网膜后极部，观察光凝术后视网膜组织形态的病理改变，为防治光凝副作用的研究提供实验基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康成年有色家兔18只，雌雄不限，体质量1.5～2.5kg，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。实验前经裂隙灯、眼底镜检查双眼无异常。双眼均为实验眼，依术后观察时间点1，3，7，14，21，28d分为6个亚组，每组3只。 仪器设备：532nm激光机:法国Quantel Medical SA公司的Viridis Twin型;北京航空航天大学设计的多功能真彩色病理图像分析系统:CMIAS 2000型;荧光素眼底血管造影仪:日本TOPCON公司TRC50Ex型;LKB公司11800修块机;8800超薄切片机;日立H600透射电镜。

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型建立

　　复方托品酰胺眼液和100g/L新福林散瞳，肌注盐酸氯胺酮(50mg/kg)和地西泮(2.5mg/kg)麻醉后，5g/L丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用532nm激光机在视盘下方1～2DD击射30点。激光击射参数:光斑直径100μm，功率0.45W，时间0.05s，光斑间距100μm;激光反应斑为Tso分级Ⅲ级[1]。荧光素眼底血管造影：(1)激光照射后3，7，14，21，28d各一次FFA检查。动物麻醉后立即于耳缘静脉内推注200g/L荧光素钠0.2mL，10min后拍摄荧光素造影照片。比较各时间亚组光凝斑荧光渗漏程度。(1) 荧光渗漏程度评判标准每一时间点观察180个光凝斑定高荧光斑为++++;光斑中心出现小的遮蔽荧光，周围荧光中度渗漏为+++;光斑中心区遮蔽荧光增强,周围荧光轻度渗漏为++ ;光斑中心区遮蔽荧光增强,周围可见透见荧光，边界清晰为+;光斑中心区遮蔽荧光，无透见荧光为0。

　　1.2.2病理学标本制作

　　光镜标本制作：于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方缝线标记后置于40g/L的多聚甲醛中固定24h，去除眼前节，然后沿视神经旁开白1mm矢状剖开眼球，取包括激光斑的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，制成3μm厚的连续石蜡切片，常规HE染色光镜下观察。电镜检查标本制作：取激光击射后1，3wk眼球和正常对照组眼球作电镜检查，去除眼前节，切取光凝部位的全层眼球壁组织，置入25g/L戊二醛前固定48h，通过解剖显微镜辨别激光点,将临近激光点的正常视网膜1mm×2mm组织条块以10g/L四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，连续半薄切片(片厚1μm)定位，超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜下观察。

　　1.2.3定量图像分析

　　应用北京航空航天大学设计的多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS2000型)进行图像分析,定标比例尺单位为微米。参照Solbegry等[2]的方法稍加改进，在200倍显微镜下，选每个视网膜光凝斑的最大直径剖面为一个视野,每个标本随机选5处视野。进行视网膜光凝斑的直径测量;高倍显微镜下计数视网膜细胞存活率，两人分别计数，取平均值。形态学定量指标的确定：(1)视网膜光凝斑的直径：200倍显微镜下，用多功能真彩色病理图像分析系统根据RPE改变和视网膜各层细胞变化确定每个激光损伤灶的边界，从边界垂直色素上皮层作两条从RPE到GCL直线，两直线中点之间的距离为视网膜光凝斑的直径，计算机自动输出结果。(2)视网膜细胞存活率：为视网膜光凝斑范围内各层(RPE层除外)存活的细胞数和临近损伤灶与光凝斑相同范围健康组织存活细胞的比率。用多功能真彩色病理图像分析系统，先在200倍显微镜下根据RPE改变和视网膜各层细胞变化确定每个激光损伤灶的边界;再在高倍显微镜下计数，两人分别计数，取平均值。

　　统计学处理：所有数据以SPSS12.0统计软件包进行处理，计量资料用±s表示，采用双因素方差分析，q检验进行两两比较，以P<0.05为统计上具有显著性差异。

　　2结果

　　2.1眼底检查及眼底血管荧光素造影

　　光凝后1d眼底激光斑呈灰白色水肿改变，中间有浓白色中心;光凝后7d激光斑中心呈灰色改变周围白色边缘，部分激光斑有水肿晕;光凝后14～28d激光斑呈黑灰色改变，水肿晕消失,且光凝斑之间有融合的趋势。光凝后3d，部分光凝斑为高荧光，其余的可见中心出现小的遮蔽荧光，周围荧光轻微渗漏;光凝后7d,荧光渗漏基本消失，中心区遮蔽荧光增强，周围可见透见荧光或荧光轻微渗漏;光凝后14～28d渗漏消失,中心区遮蔽荧光进一步增强。

　　2.2光凝斑荧光渗漏程度评判结果    激光损伤组不同时间光凝斑荧光素渗漏程度比较

　　其中++++、+++和0度者3～14d各时间组比较F=22.38 P<0.01,说明光凝斑荧光渗漏程度随时间逐步减轻, 14d趋于稳定。

　　2.3组织病理学检查

　　光镜下组织学改变：正常色素兔视网膜各层细胞完整、结构清晰，有色素上皮层。光凝后 1d反应：视网膜激光损伤灶光镜下均为典型的小丘状形态破坏,杆锥体细胞层内外节结构紊乱或消失，ONL细胞可见凝固坏死、核崩解、碎裂;视网膜下间隙可见大量细胞碎屑;可见脉络膜血管扩张，血栓形成,白细胞浸润; RPE空泡变性或连续性中断;INL层和GCL较大的空泡水肿。3d反应:外核层细胞移位、聚集、核深染，激光损伤区RPE缺失, ONL层减少或缺失,视网膜下间隙细胞碎屑减少，吞噬了色素的巨噬细胞已迁徙至视网膜内层，其余视网膜内层结构细胞排列紊乱。7d反应:视网膜下间隙细胞碎屑消失，由散在的成纤维细胞和胶质细胞出现于视网膜外层,病灶变薄,杆锥细胞层与外核层萎缩消失,含有色素的吞噬细胞迁徙至视网膜内层，特异性改变是RPE与杆锥细胞形成灶状粘连,而周围正常视网膜杆锥细胞层易与RPE分离，偶可见视网膜内层组织(神经节细胞层和神经纤维层)的破坏。14～28d：RPE萎缩或增殖，杆锥细胞层和外核层细胞萎缩甚至消失，可见视网膜内层组织(神经节细胞层和神经纤维层)完好无损。电镜下超微结构改变：正常兔视网膜超微结构:视杆外节膜盘结构清晰,排列整齐,内节线粒体嵴连续,呈长圆形,神经节细胞、外核层细胞核排列紧密,染色均匀,形态规整。光凝斑周围正常视网膜超微结构可见：光凝后7d，部分感光细胞轻度核固缩,染色质集边,出现早期凋亡改变。视杆外节膜盘轻度肿胀、模糊;部分神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻度扩张。光凝后21d，感光细胞进一步核固缩,染色质集边，部分出现核碎裂，凋亡小体出现;部分神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻中度扩张，细胞核改变不明显。激光损伤组光凝斑直径和视网膜细胞存活率的动态变化

　　2.4形态学定量指标测定

　　光凝后1,3d及1,2,3,4wk视网膜光凝斑直径和视网膜细胞存活率的动态变化。视网膜光凝斑直径光凝后1d最大为116.4±9.6μm(P<0.01)，比参照光斑增大了54.6%，随后有下降的趋势，21d后趋于稳定。视网膜细胞存活率光凝后1d最小为(29.5±4.2)%(P<0.05)，随后有上升的趋势21d为(48.2±4.4)%后趋于稳定。

　　3讨论

　　视网膜光凝术是治疗眼底疾病的一种重要有效手段，尽管已是临床上较成熟的操作技术，并取得了很好的治疗效果。但来源于治疗过程的一些并发症是难以避免的，如：光凝时局部热扩散导致Bruch膜破裂，脉络膜充血和血栓形成，神经纤维层损伤等[3]。在治疗临近黄斑中心凹的病变时，约20%患者术后可出现即刻或进展性视功能损害;神经胶质瘢痕可能发生进行性扩大，有报道1a时间内可扩大40%[46]，其发展的过程及机制不太清楚。由于血管阻塞性缺血性增殖性视网膜病变(糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜血管炎等)在临床的多发性，使全视网膜光凝术(panretinal photocoagulation, PRP)得到广泛应用。根据Tso的分级:血管阻塞性缺血性增殖性视网膜病变均应达到视网膜Ⅲ级光凝斑，但Ⅲ级光斑易产生无效光斑和过量光凝光斑[7]。为确定损伤程度的一致性，本研究在预试验的基础上，用倍频532nm激光光凝色素家兔后极部(色素兔的视盘下方)，建立兔视网膜Ⅲ级光斑激光损伤动物模型，从组织病理学上探讨视网膜光凝术后组织损伤修复机制。因色素家兔眼底所含黑色素与人眼相近,故为532nm激光对人眼视网膜损伤提供实验参考，为临床眼病激光治疗减少光凝副作用提供依据。

　　本研究发现,Ⅲ级光凝斑主要影响视网膜外层。急性期(3d内)组织学改变为RPE和内外核层部分细胞坏死或凋亡，炎症细胞的浸润，视网膜下间隙可见大量细胞碎屑，偶见神经纤维层和神经节细胞水肿，3d后坏死细胞和细胞碎屑主要由巨噬细胞和色素上皮细胞吞噬清除,留下视网膜的缺损主要由Müller胶质细胞修复。7d后表现中度RPE增殖，并向视网膜内伸展;星形细胞和Müller氏细胞到达视网膜下间隙，与增殖的RPE细胞、成纤维细胞形成脉络膜视网膜瘢痕，整个视网膜萎缩变薄。Cho等[8]用Ⅲ级光斑对10个兔眼视网膜进行光凝,第1，3，5，7d进行组织病理学和超微结构研究,发现外层视网膜比内层损伤重,研究结果与本研究类似。

　　以往的研究对激光损伤范围内视网膜组织超微结构观察报道较多，但颇少见对光凝斑周围的正常视网膜组织的超微结构观察报道。本实验电镜下对光凝斑周围的正常视网膜组织的超微结构观察显示，光凝后7d，部分感光细胞轻度核固缩,染色质集边,出现早期凋亡改变。视杆外节膜盘轻度肿胀、模糊;神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻度扩张。激光照射后21d，感光细胞进一步核固缩,染色质集边，部分出现核碎裂，凋亡小体出现;部分神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻中度扩张，细胞核改变不明显。在光镜下，Ⅲ级光凝斑对神经节细胞损伤不明显，而电镜下神经节细胞的线粒体、内质网的改变，提示光凝会导致周围正常视网膜组织的非选择性损害，这种损害是一个扩展性、进行性过程。

　　对形态学定量指标(视网膜光凝斑的直径和视网膜细胞存活率)的检测结果显示视网膜光凝斑直径光凝后1d最大，可达116.4±9.6μm，7d后光凝斑直径明显减小，21d变化趋于稳定仍大于75μm，提示光凝术后存在迟发损伤反应,可能是由于视网膜细胞受激光刺激的影响，炎症反应产生各种炎症因子及各种细胞活性物质由损伤局部向外周弥散，损伤周围正常组织，使病灶的范围远远大于光斑。因此临床应用选择光斑大小时应考虑光凝斑会继续增大的因素,确定合适的光斑间距离。视网膜细胞存活率光凝后第1d最低为(29.5±4.2)%，以后有上升的趋势，21d最大为(48.2±4.4)%，随后的轻微下降，推测可能与光感受器细胞，色素上皮细胞的凋亡有关[912]。在本实验中未发现光凝斑有不断扩大的趋势，这可能是由于观察时间不够长，或者是由于正常兔和有病变动物的视网膜细胞对激光损伤反应的敏感性不一样。一般认为结构的变化决定功能的变化,功能的变化反映了结构的变化。本实验引入了定量病理学的概念,使形态学观察由定性到定量,更客观、更真实。

　　除组织病理学方法外,眼底荧光血管造影是检查视网膜损伤的最好方法[11,12]。由于色素兔的视盘下后极部相当于黄斑,正常视网膜色素上皮细胞间为紧密连结,阻止脉络膜中的一些物质进入视网膜神经上皮层内,形成视网膜外屏障,激光破坏色素上皮细胞及其连结,损伤其屏障作用[13,14],故光凝后3d内,光斑区出现荧光渗漏,并扩散到光斑区周围视网膜内,使光斑边界模糊。光凝后第3～7d，视网膜色素上皮细胞及其连逐渐修复,使荧光渗漏减轻,光斑中心区修复明显,故光斑中心区开始出现遮蔽荧光。光凝后7～14d,增生的色素上皮细胞基本覆盖病损区,细胞间紧密连结逐渐形成,视网膜外屏障基本恢复,其光斑周围可见透见荧光,光斑周界比较清楚。光凝后第14～28d，增生的色素上皮细胞完全覆盖病损区，光斑中心出现遮蔽荧光，由于部分色素上皮萎缩脱色素，光斑周围仍可见少量透见荧光。激光视网膜损伤所致的视网膜功能下降是由多方面的因素造成的,由于激光的光凝固直接损伤所致的视网膜功能的损害是难以避免的，因此除了选择有效光斑及防范措施外，运用药物干预其他的损害因素，可能为减轻视网膜光凝副作用拓宽思路。

　　【参考文献】

　　1 Tso MOM. Retinal photoooagulation therapy: Clinical application and biological basis of therapeutic effects . Retinal Diseases1988:246

　　2 Solbegry Y,Rosner M,Turetz J, et al. MK801 has neuroprotective and antiproliferative effects in retinal laser injury. Invest Ophthalmol Vis Sci1997;38(7):13801389

　　3马效工,熊丽霞.视网膜激光损伤的研究及治疗进展. 眼科 2001;10 (2):121123

　　4 Brancato R, Pece Avanza A, Radrizzani E. Photocoagulation scar expansion after laser therapy for choroidal neovascularization in degenerative myopia. Retina1990;10:239243

　　5 田晓燕,刘涛.激光光凝治疗糖尿病性视网膜病变疗效分析.国际眼科杂志 2008;8(2):408409

　　6 Dastgheib K, Bressler SB, Green WR. Clinic opathologic correlation of laser lesion expansion after treatment of choroidal neovascularization. Retina1993;13:345352

　　7孙心铨.提高和发展眼底病激光技术提高全视网膜光凝术的疗效.眼科 2003;12(3):132133

　　8 Cho HK, Park YW, Kim YJ, et al. Histopathologic and ultrastructural findings of photocoagulation lesions produced by transpupillary diode laser in the rabbit retina. J Korean Med Sci1993;8:420

　　9刘怡,何守志.氩绿激光致SD大鼠视网膜组织细胞凋亡的实验研究.眼科研究 1999;17(6):448450

　　10 Barak A, Goldkorn T, Morse LS. Laser induces apoptosis and ceramide production in human retinal pigment epithelial cells. Invest Opthalmol

　　Vis Sci2005;46(7):25872589

　　11 Desmetter T, Devoisselle JM, SoulieBegu S, et al. Value of fluoresce in angiography in control of retinal thermal damage due to diode laser. J Fr Ophthalmol1999;22(7):730

　　12 Mordon S, Desmetter T, Devoisselle JM. Quantitative fluoresce in an giography following diode laser retinal photocoagulation. Laser Surg Med1999;24(5):338

　　13彭超,黄观,沈效军,等.氩激光治疗糖尿病视网膜病变疗效观察.国际眼科杂志 2007;7(3):833834

　　14 Pallack A, Korte GE. Restoration of the outer bloodretinal barrier after krypton laser photocoagulation. Ophthalmic Res1993;25(4):201