耳聋-掌跖皮肤角化综合征的连接蛋白基因型和表型分析

作者：袁永一,戴朴

【摘要】目的　GJB2、GJB6、 GJB3基因与遗传性耳聋及角化病有关， 以GJB2、 GJB6、 GJB3基因为候选基因，研究1例伴有掌跖角化病的综合征型耳聋先证者的分子病因, 探讨其表型及遗传特征。方法　采集先证者及其父母外周血并提取DNA， 对GJB2、 GJB6、 GJB3基因编码区进行PCR扩增， 以直接测序的方法进行突变分析。 结果　先证者及其父母GJB3、 GJB6基因测序未发现突变。先证者携带GJB2基因R75W单等位基因突变，其父母未携带此突变,在证实先证者与其父亲的亲子关系后明确先证者携带的R75W为新生突变。301名中国正常对照中未发现GJB2 基因R75W突变。 结论　在中国首次发现了GJB2 基因新生突变R75W，此突变可能以显性方式遗传， 导致耳聋-掌跖皮肤角化综合征。在不同种族R75W导致的耳聋多为双侧重度到极重度感音神经性聋，而皮肤表型的严重程度有所不同。 【关键词】  综合征型耳聋；　掌跖角化病；　GJB2基因；　GJB6基因；　GJB3基因　　连接蛋白（connexin, Cx）组成缝隙连接通道, 使相邻细胞的离子、 代谢物质和分子量小于1 ~ 1.5 kDa的信号分子得以直接转运。缝隙连接是细胞间通讯的结构基础， 对胚胎发育、形态构建、增殖分化以及细胞群的协调活动具有重要意义。 在人类已发现20种连接蛋白，基于核苷酸和氨基酸水平上的相似性它们被归入α、 β、 γ及ε四个亚类。GJB2、 GJB3、GJB6基因分别编码连接蛋白26， 31， 30（Connexin26、 31、 30， Cx26、 31、 30），这三种蛋白同属连接蛋白β亚类，表达于外胚层来源的组织中，特别是在人类的耳蜗和皮肤组织［1-3］。这三种基因突变均与遗传性感音神经性耳聋有关，可以引起非综合征型聋（nonsyndromic hearing impairment, NSHI）和综合征型聋（syndromic hearing impairment, SHI）， 其中又以GJB2基因最为突出。耳聋合并掌跖皮肤角化为综合征型聋的一种。GJB2、 GJB3、 GJB6 基因突变导致的综合征型耳聋以听觉系统合并表皮系统的病变为多见。本文以此为依据对一个耳聋掌跖皮肤角化综合征家系进行分子病因学研究，探讨其表型和遗传学特点。

    1　资料与方法

    1.1　家系资料

    　　先证者， 女性， 15岁， 内蒙古自治区人，汉族，患有先天性耳聋。无耳聋家族史及耳毒性药物应用史，无皮肤疾病家族史，先证者母亲孕期无外伤及耳毒性药物应用史（见图1）。自1岁起手足局部皮肤角化增厚， 脫屑， 外用中药治疗多次未见好转（见图2）。全身体检： 双手手掌手背交界处和双足足底足背交界处皮肤角化增厚、 脱屑，足部病变较手部严重。系统查体其他部位未见异常。耳科检查：双侧外耳及鼓膜正常。纯音测听： 先证者双耳极重度感音神经性聋， 无残余听力，先证者母亲听力正常，父亲左耳为轻度高频听力下降，右耳为中度高频听力下降（见图3）。追问病史先证者父亲长期在噪声环境下工作。

    1.2　DNA提取方法

    　　采集受检者外周血3 ~ 5 ml，应用试剂盒提取DNA（上海华舜生物工程有限公司），提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。取适量提取DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测，其余保存于 －70℃ 备用。本研究提取的双链DNA浓度为250 ?滋g/ml， 260/280的比值为1.8（260/280的比值在1.5 - 2.0之间说明纯度较好）。

    1.3　耳聋基因突变分析方法

    1.3.1　GJB2基因： GJB2基因编码区扩增引物及PCR反应条件见参考文献［４］。

    1.3.２　GJB6基因：应用 GeneTool 设计包含 GJB6  整个编码区的测序引物， F: 5'   TTGGCTTCAGTCTGTAATATCACC3'，R: 5' TCATTTACAAACTCTTCA GGCTACAG 3'， 扩增产物 990  bp， 引物由北京奥科生物公司合成。在 50 ?滋L 反应体系中加入100 ng 基因组 DNA，10 × Buffer（含MgCl2 25 mmol/L）缓冲液  5 ?滋L，10 × dNTP（4 mmol/L）5 ?滋L，引物（2 pmol/?滋l）各2.5 ?滋L， Taq酶（法特捷， 2.5 U/?滋L）1 ?滋L， 其余由去离子水补齐。PCR 反应在 2700 热循环仪（美国ABI 公司）上完成。反应条件： 94℃ 预变性 5 min， 94℃变性 0.50 min， 65℃复性 0.50 min, 72℃ 延伸       0.50 min， 30个循环， 反应终止后再72℃ 延伸5 min， 4℃ 保存。GJB3基因： 应用 GeneTool 设计包含GJB3整个编码区的引物， F: 5' TACGATG-GTTTTTCCTCTAATTCT3'， R: 5'  TTG-CATAACT-TAGT-GAACTCAGAG3'， 扩增产物 986 bp， 引物由北京奥科生物公司合成。在25 ?滋L 的反应体系中   加入40 ng的基因组DNA， 10 × Buffer（含MgCl2        25 mmol/L）缓冲液2.5 ?滋L， 10 × dNTP（4 mmol/L）   2.5 ?滋L， 引物（2 pmol/?滋l） 各1.5 ?滋L， Taq 酶（法特捷， 2.5 U/?滋L） 0.75 ?滋L， 其余由去离子双蒸水补齐。PCR 反应在 2700 热循环仪（美国 ABI 公司）上完成。反应条件： 94℃ 预变性 5 min， 94 ℃ 变性  0.50 min， 55℃ 复性 0.5 min, 72℃ 延伸 0.75 min， 30 个循环， 反应终止后72℃ 延伸 5 min， 4℃ 保存。

　　GJB2、GJB6、GJB3基因PCR产物送北京华大中生科技发展有限公司进行正向引物测序，发现序列变异后以反向引物测序证实。 应用GeneＴool进行测定序列与标准序列的比对，标准序列参照GJB2:   NM_004004， GJB6： ENSG00000121742， GJB3: NM_024009。

    　　另外，以直接测序的方法对先证者进行了SLC26A4 基因、 线粒体 12S rRNA、  线粒体 tRNA Ser（UCN）等与耳聋关系密切的基因的检测，方法及反应条件     见参考文献［4， 5］。

    2　结　果

    　　测序证实先证者携带GJB2基因杂合突变223C>T（见图4）， 这一突变使Cx26第 75位密码子编码的精氨酸被色氨酸取代（R75W），在人类、 猩猩、 羊、 大鼠、小鼠及非洲爪蟾等物种中进行Cx26氨基酸序列保守性分析显示R75位点高度保守（见图5）。GJB6基因编码区、 GJB3基因编码区测序未发现致病突变。

    　　SLC26A4基因、 线粒体12SrRNA、 线粒体   tRNA Ser（UCN）测序未发现致病突变。

    　　先证者父母GJB2基因编码区测序显示双方均未携带223C>T突变。301例北方听力正常人群GJB2基因测序未发现此突变。

    　　STR（Short tandem repeat, 短串联重复）位点和Amelogenin（釉质素）位点的基因分型证实了先证者与其父亲的血缘关系（详见表1）。

    3　讨    论

    　　GJB2基因突变与遗传性非综合征型耳聋密切相关，包括常染色体显性遗传性聋DFNA3和常染色体隐性遗传性聋DFNB1，是遗传性耳聋最常见的原因［6-7］。此外，GJB2基因还与角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征（keratitis-ichthyosis-deafness syndrome, KID）和多汗性外胚层发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)等疾病有关［8］。由GJB2基因突变导致的感音神经性耳聋及皮肤、毛发、指（趾）甲和角膜的病理改变可以单独出现也可以多种联合出现［9］。

    　　连接蛋白家族的GJB6、 GJB3基因发生突变也可以导致耳聋和皮肤病变：GJB3基因突变导致耳聋及变异性红斑角化病［10］； GJB6基因突变导致耳聋、多汗性外胚层发育不良、角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征以及先天性无毛症等疾病［11］。我们对先证者进行GJB6和GJB3基因编码区测序未发现任何突变，与耳聋关系密切的SLC26A4基因、线粒体12S rRNA、线粒体tRNA Ser（UCN） 检测未发现致病突变，排除了其他常见耳聋基因参与先证者耳聋发病的可能性，考虑GJB2基因R75W是先证者耳聋和皮肤表型产生的原因。

    　　1998年Richard［12］等首先报道GJB2基因R75W为显性突变，可以导致遗传性综合征型耳聋。本文报道的先证者携带GJB2基因R75W杂合突变，表型为极重度感音神经性耳聋和掌跖皮肤角化，该患者无耳聋及皮肤疾病的家族史，其父母GJB2基因检测均不携带R75W突变。为证实先证者与其父亲的血缘关系我们研究了两者的STR位点和Amelogenin位点基因分型，证实亲子可能性大于99.9%，因此考虑先证者的GJB2基因R75W突变为新生突变，这是中国首次发现的GJB2 基因新生、显性突变。此精氨酸位于Cx26 第一胞外区(EC1)与第二跨膜区的（TM2）交界处，胞外区是连接子对接的关键部位，完整的跨膜段是连接蛋白从胞浆转运至胞膜必不可少的条件，这两个区域的氨基酸序列高度保守，R75也不例外，这对维持连接蛋白的正常功能至关重要。R75W使Cx26第 75位密码子编码的保守的精氨酸被不保守的色氨酸取代，导致了耳聋及皮肤表型的出现。对R75W突变的功能研究证实75位为色氨酸的突变蛋白不但本身失去活性同时还抑制野生型蛋白的活性［12］， 呈现显性负性效应。

　Cx26 第75位的精氨酸除了被色氨酸取代这种形式外还可被谷氨酰胺取代（R75Q）， R75Q也可导致常染色体显性综合征型和非综合征型耳聋［13］。2005年Feldmann等［14］报道了两个与GJB2基因R75Q 新生突变有关的耳聋家系，其中一家系携带R75Q 新生突变的病人仅有感音神经性耳聋的表型，另一家系携带R75Q新生突变的病人除感音神经性耳聋外还有皮肤角化的表型。迄今为止， R75W和R75Q是GJB2基因中唯一被报道的发现新生突变的位点，这在一定程度上证明了Cx26第75位密码子编码的精氨酸与听觉关系的密切性，并且说明这一区域可能是GJB2基因显性遗传方式中的一个突变热点。值得提出的是，包括我们的研究在内目前报道的R75 位点突变均导致程度较重的耳聋表型：重度到极重度感音神经性聋，而皮肤表型严重程度差别较大。Richard报道的R75W突变埃及家系皮肤病变表现为手掌足底皮肤弥漫性增厚、过度角化、皮肤干裂、大片脱皮，而我们的病人仅表现为手掌手背交界处和双足足底足背交界处皮肤角化增厚、脱屑，这种表型差异的产生可能与种族和环境等因素有关。为进一步研究R75W突变表型及外显率，有必要对该先证者进行长期随访。

【参考文献】1　Di WL, Rugg EL, Leigh IM, et al. Multiple epidermal connexins are expressed in different keratinocyte subpopulations including connexin 31. J Invest Dermatol, 2001, 117(4): 958-964.

2　Xia AP, Katori Y, Oshima T, et al. Expression of connexin 30 in the developing mouse cochlea. Brain Res, 2001, 898(2): 364-367.

3　Rabionet R, Gasparini P, Estivill X. Molecular genetics of hearing impairment due to mutations in gap junction genes encoding beta connexins. Hum Mutation，2000, 16(3): 190-202.

4　戴朴，于飞，康东洋，等. 线粒体DNA1555位点和GJB2基因及SLC26A4基因的诊断方法及临床应用.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2005， 40（10）： 769-773.

5　刘新. 线粒体DNA A1555G突变分子流行病学调查及线粒体聋病分子机制的研究[D]. 北京：中国人民解放军军医进修学院、中国人民解放军总医院， 2006.

6　Kelley PM, Harris DJ, Comer BC, et al. Novel mutations in the connexin 26 gene （GJB2） that cause autosomal recessive (DFNB1) hearing loss. Am J Hum Genet. 1998, 62（４）: 792-799.

7　Fuse Y, Doi K, Hasegawa T, et al. Three novel connexin26 gene mutations in autosomal recessive non-syndromic deafness. Neuroreport, 1999, 10(9): 1853 -1857.

8　Van Steensel MA， Steijlen PM， Bladergroen RS， et al. A phenotype resembling the Clouston syndrome with deafness is associated with a novel missense GJB2 mutation. J Invest Dermatol, 2004, 123(2): 291-293.

9　Richard G. Connexin gene pathology. Clin Exp Dermatol, 2003, 28(4): 397-409.

10　Richard G, Brown N, Smith L E, et al. The spectrum of mutations in erythrokeratodermias-novel and de novo mutations in GJB3.Hum Genet, 2000, 106(3): 321-329.

11　袁永一， 戴朴， 黄德亮. GJB6基因突变与遗传性耳聋. 中华耳科学杂志, 2005, 3(4): 282-288.

12　Richard G, White TW, Smith LE, et al. Functional defects of Cx26 resulting from a heterozygous missense mutation in a family with dominant deaf-mutism and palmoplantar keratoderma. Hum Genet, 1998, 103（４）: 393-399.

13　Uyguner O, Tukel T, Baykal C, et al. The novel R75Q mutation in the GJB2 gene causes autosomal dominant hearing loss and palmoplantar keratoderma in a Turkish family. Clin Genet. 2002， 62（４）: 306-309.

14　Feldmann D, Denoyelle F, Blons H, et al. The GJB2 mutation R75Q can cause nonsyndromic hearing loss DFNA3 or hereditary palmoplantar keratoderma with deafness. Am J Med Genet　A, 137A（２）: 225-227.