TNF-α基因多态性与分泌性中耳炎的关联
发表时间：2012-04-20 浏览次数：756次
作者：谭慧欢，黄海玲，解继胜，赵琼芝 作者单位：广西百色市人民医院，右江民族医学院附属西南医院耳鼻喉科，广西百色533000;右江民族医学院组织与胚胎学教研室，广西百色533000
【摘要】 目的 探讨TNF-α基因启动子-238G/A多态性与分泌性中耳炎(SOM)的相关关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测125例SOM患者和130例健康对照者TNF-α基因启动子-238G/A多态性。结果 TNF-α-238基因型GG、GA频率在对照组和SOM组分别为93.85%，6.15%和85.60%，14.40%;等位基因G、A频率在对照组和SOM组分别为96.92%，3.08%和92.80%，7.20%。两组差异均有显著性(P<0.05)，携带GA基因型个体患SOM的风险约是GG基因型的2.565倍(OR=2.565，95%CI=1.072～6.138)。结论 TNF-α-238基因多态性与SOM的发病有相关性，A等位基因可能是SOM的遗传易感基因。
【关键词】 肿瘤坏死因子-α;基因多态性;中耳炎，伴渗出液
The association of gene polymorphism of tumor necrosis factor-alpha with secretory otitis media
TAN Hui-huan, HUANG Hai-ling, XIE Ji-sheng, ZHAO Qiong-zhi
1. Baise People’s Hospital, Department of Otorhinolaryngology, Affiliated South-west Hospital of
Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China;
2. Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China
Abstract: Objective To examine the association between polymorphism of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)-238 G/A promoter with secretory otitis media (SOM). Methods The polymorphism of TNF-alpha was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) methods in 125 patients with SOM and 130 healthy controls. Results TNF-alpha genotype frequencies of GG, GA were 93.85%, 6.15% and 85.60%, 14.40% in SOM group and control group, respectively. Allele frequencies of G, A were 96.92%, 3.08% and 92.80%, 7.20% in SOM group and control group, respectively. There was statistically significant difference in frequencies of allele and genotype in TNF-alpha polymorphism between SOM group and control group (P<0.05). The relative risk suffered from SOM in patients with GA genotype was as 2.565 times as those with GG genotype (OR=2.565, 95%CI=1.072～6.138). Conclusion TNF-alpha-238 polymorphism is positively associated with the genesis of SOM, and A allele maybe a risk factor for SOM.
Key words: tumor necrosis factor-alpha; gene polymorphism; otitis media with effusion
分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)是以中耳积液及听力下降为主要特征的中耳非化脓性炎性疾病，小儿的发病率比成人高，是引起小儿听力下降的重要原因之一。目前SOM发病确切机理尚未完全明了，近年国内外的研究[1]表明免疫反应与SOM的发病关系密切，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)在SOM免疫反应中的作用日益被耳科学者重视，已成为研究SOM发病机理的活跃领域。有研究证实[2]，TNF-α基因多态性与多种疾病相关，但TNF-α基因多态性与SOM是否关联，目前尚不清楚，为此，我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，探讨TNF-α基因多态性与SOM的关系，为揭示SOM的发病机理提供一定的实验依据和新的视角。
1 对象与方法
1.1 研究对象
SOM组：经纯音测听、声导抗测试、鼓膜穿刺等检查确诊为SOM患儿(排除鼻咽部疾病者)125例，男68例，女57例，年龄3～16岁，平均9.8岁;病程1～16周。对照组：正常健康体检，无中耳炎病史、耳部正常儿童130例，男68例，女62例，平均10.4岁。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA的制备
采集体检健康者静脉血2ml，用EDTA-K2抗凝;采用已建立的改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-30℃保存备用。
1.2.2 引物合成
参照文献[3]设计合成一对引物(北京赛百盛有限公司合成)，扩增TNF-α基因启动子区的一段DNA序列。上游引物：5'-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3'，下游引物：5'-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3'。
1.2.3 PCR扩增条件
PCR反应体系包括5.0μl基因组DNA，2.5μl 10×PCR Buffer，2.0μl 2.5mmol/L dNTPs, 1.5μl 25mmol/L MgCl2，引物各20 pmol/μl，Taq DNA聚合酶1.25u，所有试剂均为大连宝生物公司产品。PCR反应循环参数：95℃预变性反应3min;94℃变性50s，59℃退火1min，72℃延伸1min，33个循环;72℃延伸5min，4℃保存，以上反应均在GeneAmp PCR System 2700型(美国PE公司)基因扩增仪上完成。
1.2.4 扩增产物的限制性酶切
取PCR扩增产物10μl，用10u限制性内切酶(英国Biolabs公司提供)Msp I于37℃酶切1h。反应终止后，产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，染色后以DNA片段长度标准物为参考，在紫外灯下判断结果，并拍照。
1.3 统计学处理
用基因直接计数法计算TNF-α的基因型及等位基因频率，疾病组和对照组间基因型及等位基因频率用χ2检验，均在SPSS11.0软件包上完成。
2 结果
2.1 TNF-α基因型分析
TNF-α基因-238G/A多态性，PCR扩增产物片段大小为152 bp，根据限制性内切酶Msp I酶切片段的情况，基因型有两种，GG型(133 bp、19 bp 2条带)、GA型(152 bp、133 bp、19 bp 3条带)，在两组人群中均未检出AA基因型，见图1。
2.2 SOM组与对照组TNF-α基因多态性的比较
TNF-α -238G/A位点基因型在两组中的分布差异有显著性(χ2=4.732，P<0.05);等位基因频率在两组中差异有显著性(χ2=4.478，P<0.05);SOM组TNF-α GA基因型明显升高，关联分析结果显示，SOM组与TNF-α基因多态性存在关联(χ2=4.732，P<0.05，OR=2.565，95%，CI=1.072～6.138)，见表1。表1 两组TNF-α -238基因型及等位基因频率分布的比较 (略)
3 讨论
TNF是一种促炎细胞因子，主要由单核或巨噬细胞分泌，包括TNF-α和TNF-β两种。它可诱导自身及IL-1、IL-6等其它细胞因子产生，增加白细胞相关抗原(HLA)-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达，促进T、B淋巴细胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和调节免疫的功能。近年研究证实[4]，适量的TNF可调整机体的免疫及代谢作用，在维持机体内部环境的稳定状态及抵制各种致病因子具有重要意义，但是过量的TNF则会导致各种病理改变。
随着分子生物学和分子遗传学研究的不断深入，人们已经认识到基因的多态性可以造成某些疾病不同的易感性。人TNF基因位于第6号染色体短臂MHC Ⅲ类基因区一段长7 kb的DNA序列内，其中TNF-α基因长4 kb，含4个外显子和3个内含子。有研究证实[5]TNF-α基因启动子区域-238位点存在G/A多态性，这种基因多态性的存在可能影响TNF基因转录和表达，进而影响TNF的生物学功能，可导致TNF的血清水平发生改变。
SOM发病确切的发病机理尚未明确，目前认为咽鼓管功能障碍、感染和免疫反应是三大致病原因，此外家族中有中耳炎患者为患病的危险遗传因素。大量研究表明，TNF-α基因-238位点多态性与青春期单发关节炎[6]、慢性乙肝[7]和口腔鳞状细胞癌[8]等多种疾病存在密切相关性，但TNF-α基因多态性与SOM是否存在关联性的研究很少。因此，我们检测了125例SOM患者TNF-α基因-238位点多态性的分布，从遗传和免疫反应角度探讨SOM的发病机理。
实验结果发现，TNF-α -238G/A位点基因型在两组中的分布差异有显著性(P<0.05);等位基因频率在两组中的差异也存在显著性(P<0.05);其中携带GA基因型个体患SOM的风险约是GG基因型的2.565倍(OR=2.565，95%，CI=1.072～6.138)，提示A等位基因可能是SOM的遗传易感基因。
综上所述，SOM是一种可严重影响小儿听力的常见病，除上述因素外，遗传因素在其中也起着重要的作用，通过我们的研究可以发现，TNF-α基因-238G/A位点多态性与SOM存在关联，A等位基因可能是SOM的遗传易感基因。TNF-α基因多态性与SOM的研究才刚起步，还有待进行大样本、多地域、多民族广泛深入的协同研究，将有可能为SOM的风险预测、及早预防和个性化治疗提供一条新的线索和途径。
【参考文献】
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