Apollon蛋白在胃癌组织中的表达及意义

　　作者：刘奇,张云新,魏振彤,冯野,王雪峰,赵吉　　作者单位：吉林大学第三临床医学院，吉林 长春

　　【摘要】目的 研究Apollon基因在胃癌组织的表达及意义。方法 采用免疫组化SP法对42例胃癌组织、15例癌旁组织、10 例正常胃组织中Apollon基因表达蛋白进行检测。结果 10 例正常成人胃组织中Apollon基因均无表达,胃癌及癌旁正常组织Apollon基因表达阳性率分别均为80.9 % 和20.0%，胃癌组织明显高于正常及癌旁组织(P<0.05);Apollon基因表达与患者的年龄、性别无关(P>0.05)，而与肿瘤的分级、分期有关(P>0.05)。结论 Apollon基因表达升高与胃癌密切相关，可能参与胃癌的发生。

　　【关键词】 胃癌,Apollon基因,免疫组化

　　凋亡受抑将导致细胞生存期延长，有利于转化突变的细胞生长积累，最终导致肿瘤的产生。胃癌在发生发展过程中也受此机制影响。Apollon是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族具有抗凋亡作用的病毒蛋白，可在一些恶性肿瘤中高度表达。在国外的研究报告中已经指出Apollon基因的表达导致肝癌、新生儿急性髓细胞样白血病的发生〔1〕，对消化道肿瘤的影响国内外尚未报道。本研究采用免疫组织化学方法，检测42例胃癌组织Apollon蛋白的表达情况，并与癌旁组织、正常胃组织作比较，探讨其在胃癌发生发展中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　本院2007年3月至2008年6月石蜡包埋标本67例。其中正常胃组织10例，癌旁组织15例，胃癌组织42例。

　　1.2 试剂

　　Apollon兔抗人多克隆抗体购于ALEXIS公司;SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司为即用性。

　　1.3 检验方法

　　采用免疫组织化学SP染色，石蜡标本切片4 μm厚，用SP法做Apollon免疫组化染色，染色程序按SP试剂盒说明书进行，每批染色设立用已知阳性组织切片作阳性对照，PBS作为一抗作阴性对照。

　　1.4 免疫组化染色结果判断

　　Apollon免疫组化染色以细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，每例随机选择10个高倍视野共计算 1 000 个细胞，按阳性细胞数占总细胞数的比例计算阳性表达率,根据阳性细胞着色的范围分为阴性:阳性细胞<25%,阳性:阳性细胞 ≥25%。

　　1.5 统计学处理

　　统计学分析采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 定位观察

　　在正常胃黏膜组织中Apollon蛋白不表达;在胃癌癌组织中Apollon蛋白表达主要位于细胞浆中，偶见于核表达，呈现棕黄色染色颗粒。

　　2.2 人胃癌组织中Apollon蛋白表达检测

　　免疫组化检测表明在正常胃腺体中，Apollon蛋白表达均为阴性;癌旁组织表达率20.0%，胃癌标本Apollon表达率80.9%，胃癌组中Apollon基因蛋白表达显著高于正常组织和癌旁组织(均P<0.01)。Apollon在男女胃癌患者中的阳性率分别为80.8%和81.2%，无显著差异(P>0.05)。在年龄>60岁的标本中阳性率为80.0%，而在≤60岁的标本中阳性率为83.3%，也无显著差异(P>0.05)。在高、中分化的胃癌组中，阳性表达率为69.2%，而在低、未分化组织中阳性表达率为100%，二者差异显著(P<0.05)。有淋巴结转移的胃癌组织中Apollon蛋白表达阳性率为76.9%，而在无淋巴结转移的胃癌组织中有87.5%阳性，两者之间无显著差异(P>0.05)。对于淋巴结转移的影响考虑到本实验的病理标本样本量的大小，并不能排除与淋巴结转移无关。在胃癌的分期中可见，Ⅰ、Ⅱ期胃癌Apollon蛋白阳性表达率为65.2%，Ⅲ、Ⅳ期胃癌Apollon蛋白阳性表达率为100%，两者差异显著(P<0.05)。

　　3 讨论

　　IAPs是最强的内源性凋亡抑制因子，共发现XIAP、cIAP1、cIAP2、NAIP、Apollon、Livin、Survivin、ILP2 8个成员。Apollon是IAPs中分子量最大的成员，含有1个BIR结构域(杆状病毒IAP重复序列)及一个泛素结合结构域(UBC)。分子量为530 kD，含有4 830个氨基酸，是高尔基体外膜蛋白，具有高度保守性。Apollon的BIR序列约有40%与其他IAPs相同〔2〕，是其抑制caspase活性、抗凋亡的重要结构。UBC结构域是Apollon所特有的结构域，位于羧基端，能够加强Apollon的抑凋亡作用。

　　Apollon/BRUCE的抑制凋亡主要通过结合Smac、HtrA2以及caspase等3种机制发挥其抑凋亡作用〔3〕，而Apollon拮抗Smac及caspase9前体和成熟体的功能是抑制凋亡的重要机制〔4〕。Qiu等〔5〕在Apollon对caspase影响的研究中也阐明了其主要是前体caspase9，而不是caspase的效应器，并与caspase3无关。除了具有IAP活性外，Apollon还有一个特殊功能，即作为E2/E3泛素酶嵌合体与Smac作用。Smac能被这种E2/E3活性单泛素化。Apollon还可作为E2泛素酶参与Smac、caspase9的多泛素化，以促进两者的降解。另外HtrA2/Omi可通过其丝氨酸蛋白酶的活性促进Apollon基因的降解〔6〕。HtrA2催化活性可诱导Apollon表达的细胞产生凋亡。然而在Apollon缺乏的细胞中无催化活性的HtrA2突变体通过与IAP结合域作用也能引起凋亡。Apollon是一个高度保守的抗凋亡蛋白，具有多种功能，这主要归因于其特殊的膜定位(定位于高尔基体外膜上)，有研究表明它的抑凋亡功能可能被高尔基体网络结构抑制。另外，Apollon的调节还需通过E2 UbcH5和E3 Nrdp1的介导，Nrdp1过度表达或RNA干扰诱导凋亡的细胞中Apollon的含量减少〔7〕，这两者都是EGF受体家族成员〔7，8〕。

　　【参考文献】

　　1 Sung KW,Choi J,Hwang YK,et al.Overexpression of Apollon,an antiapoptotic protein,is associated with poor prognosis in childhood de novo acute myeloid leukemia〔J〕.Chin Cancer Res,2007;13(17):510914.

　　2 Chen ZH,Mikihiko N,Satoko H,et al.A human IAPfamily gene,apollon,expressed in human brain cancer cells〔J〕.Biochem biophys Res Commun，1999;264(3):84754.

　　3 Bartke T,Pohl C,Pvrowolakis G,et al.Dual role of BRUCE as an antiapoptotic IAP and a chimeric E2/E3 ubiquitin ligase〔J〕.Mol Cell,2004;14(6):80111.

　　4 Hauser HP,Bardroff M,Pyrowolakis G,et al.A giant ubiquitinconjugating enzyme related to IAP apoptosis inhibitors〔J〕.Cell Biol,1998;141(6):141522.

　　5 Qiu XB，Goldberg AL. The membraneassociated inhibitor of apoptosis protein，BRUCE/Apollon，antagonizes both the precursor and mature forms of Smac and caspase9〔J〕.J Biol Chem,2005;280(1):17482.

　　6 Sekine K，Hao Y，Suzuki Y，et al.HtrA2 cleaves apollon and induces cell death by IAPbinding motif in apollondeficient cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;330(1):27985.

　　7 Qiu XB,Markant SL,Yuan J,et al.Nrdp1mediated degradation of the gigantic IAP,BRUCE,is a novel pathway for triggering apoptosis〔J〕.Embo,2004,23(4):80010.

　　8 Qiu XB,Goldberg A.Nrdp1/FLRF is a ubiquitin ligase promoting ubiquitination and degradation of the epidermal growth factor receptor family member,ErbB3〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(23):148438.