14-3-3γ和ζ蛋白在小胶质细胞中表达变化的研究

　　作者：何静 孙圣刚 陈小武 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，湖北 武汉 430060 武汉市第三医院

　　【摘要】 目的 了解14-3-3γ和ζ蛋白在中枢神经系统小胶质细胞中的表达及脂多糖(LPS)刺激后其表达变化情况，探讨14-3-3蛋白与小胶质细胞释放炎症因子的关系。方法 应用小鼠小胶质细胞株BV-2作为体外小胶质细胞的模型，以LPS刺激其活化，应用免疫荧光、流式细胞术检测14-3-3γ和ζ蛋白在刺激前后的表达变化，ELISA检测TNF-α的表达。结果 小鼠小胶质细胞株BV-2在未刺激状态下表达14-3-3γ和ζ蛋白;LPS刺激细胞活化后释放TNF-α，同时14-3-3γ和ζ蛋白表达下降。结论 正常小鼠小胶质细胞高表达14-3-3γ和ζ蛋白，LPS刺激后表达下降，提示其参与了中枢神经系统免疫应答的调节。

　　【关键词】 14-3-3蛋白;小神经胶质细胞;脂多糖(LPS);肿瘤坏死因子(TNF)

　　帕金森病(PD)是一种多发于老年期的中枢神经系统退变性疾病。小胶质细胞在中脑黑质致密部分布密度明显高于其他脑区，与PD的发病密切相关;在PD患者脑中，激活的小胶质细胞释放大量的致炎性因子(TNF-α，IL-1β，IFN-γ等)，一氧化氮(NO)，活性氧产物(ROS)和花生四烯酸代谢产物对多巴胺能神经元产生毒性作用，并以瀑布效应的方式形成恶性循环，最终可导致多巴胺能神经元的退变死亡〔1〕。近年来，对PD发病机制的研究主要集中在线粒体功能异常、氧化应激、蛋白表达和折叠异常、蛋白降解功能障碍、炎症反应、神经营养障碍等几个方面。14-3-3蛋白家族是真核细胞中高度保守并广泛表达的可溶性蛋白。在细胞凋亡、生长、增殖的信号转导、细胞周期的调控及细胞间运输中发挥重要的调节作用〔2〕。已有研究发现在PD患者脑黑质中，可溶性α-Synuclein复合物的含量增加，其中含有14-3-3蛋白〔3〕，且Lewy小体的免疫组化显示14-3-3蛋白染色强阳性，以上研究说明14-3-3蛋白参与了PD脑的异常蛋白表达及细胞凋亡，但是否也参与了PD的炎症反应过程，国内外尚未报道。本研究用BV-2细胞作为小胶质细胞体外模型，LPS作为工具药激活小胶质细胞，建立炎症/免疫异常细胞模型，用免疫组化及流式细胞术观察14-3-3γ 和 ζ蛋白的表达变化，探讨其与脑内免疫炎症的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料及试剂

　　小胶质细胞(BV-2)购于中国协和医科大学细胞中心，脂多糖(LPS)，E.coli 026B6购于Sigma公司，高糖DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(武汉三利)，14-3-3蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnologies),荧光二抗FITC(武汉凌飞)，TNF-α ELISA检测试剂盒(武汉晶美)。

　　1.2 BV-2细胞培养

　　冻存复苏后的第一代细胞培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，加PG 100 U/ml;培养条件37℃恒温，5%CO2，95%空气。隔天换液一次，3～4 d传代1次。取第3～8代的细胞为实验对象，实验前无血清培养过夜，使细胞处于同步化状态。

　　1.3 LPS诱导激活及分组

　　LPS溶于无血清无抗生素的DMEM，先配成1 mg/ml的贮存液，-20℃保存，工作浓度为500 ng/ml。细胞经无血清培养过夜后，加入含LPS 500 ng/ml的DMEM培养，分别在2，6，12，24 h收集细胞及细胞上清，并设正常培养的细胞为对照组。

　　1.4 免疫荧光检测14-3-3γ和ζ表达方法

　　细胞爬片制备后用丙酮4℃固定20 min。PBS充分洗涤，5%山羊血清室温封闭30 min，一抗(浓度1∶100)4℃孵育过夜，PBS充分洗涤，二抗FITC(浓度1∶50)室温闭光孵育40 min，PBS洗涤晾干后，缓冲甘油封片，Olympus BX51荧光显微镜观察并摄像。免疫荧光结果采用Olympus MicroImage 4.0图像处理系统进行图像分析。200倍视野下，抽取30个不相重复的视野测量14-3-3γ的吸光度值。流式结果取105个细胞，观察14-3-3ζ表达的百分率以及平均荧光强度。

　　1.5 流式细胞仪检测14-3-3ζ表达方法

　　用流式管分别收集不同时间点细胞，70%冷乙醇固定，PBS洗涤，0.25%TritonX-100破膜5 min，PBS洗涤，一抗4℃孵育过夜，FITC二抗室温闭光30 min。充分洗涤后，用流式细胞仪检测。

　　1.6 TNF-α分泌检测

　　收集不同时间点的细胞培养上清，严格按TNF-α ELISA检测试剂盒说明书操作，测定含量。

　　1.7 统计学方法

　　实验数据以x±s表示。采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 免疫荧光检测14-3-3γ结果

　　14-3-3γ在激活的小胶质细胞中表达下调。随着LPS激活时间延长，14-3-3γ荧光强度逐渐减弱，6 h后更明显(P<0.05)。14-3-3γ吸光度值依次为：正常细胞1.213±0.735;LPS作用2 h,1.059±0.124;6 h,0.859±0.036;12 h,0.638±0.048;24 h,0.603±0.021。见图1。

　　2.2 流式细胞仪、免疫荧光检测14-3-3ζ的结果

　　14-3-3ζ在激活的小胶质细胞中表达下调。正常小胶质细胞高表达14-3-3ζ为97.92%，LPS 5质细胞后，随着时间延长，14-3-3ζ表达细胞数逐渐下降，2 h,91.77%;6 h,85.78%;12 h,73.95%;24 h,67.17%。平均荧光强度:正常细胞106.24±9.28;LPS作用 2 h,99.27±7.16;6 h,49.81±12.21;12 h，42.87±11.67;24 h,32.00±11.07。6 h以后组与正常组相比有显著差异(P<0.05)。见图2。

　　2.3 TNF-α分泌变化

　　图3可见，对照组几乎不表达TNF-α，LPS刺激后2 h TNF-α开始高表达,24 h后开始下降，表明小胶质细胞激活。

　　3 讨 论

　　14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，哺乳动物含有7种亚型(βγεζηδθ)，脑组织中表达最高。以同源二聚体形式存在，识别磷酸丝氨酸/苏氨酸连接的信号分子，可以同时与两个靶蛋白或一个靶蛋白的两个结构域相互作用，通过蛋白质相互作用，14-3-3蛋白在信号转导，细胞周期的调控，酶活性的调节、转录，细胞凋亡等生物过程中发挥重要的调节作用。PD患者脑的免疫组化染色显示14-3-3蛋白的 γζεθ亚型与α-Synuclein在Lewy小体中共定位〔4〕。近年来研究认为小胶质细胞的异常激活所导致的炎症反应参与了PD的DA能神经元进行性变性的进程。本实验观察到小鼠小胶质细胞激活后释放炎症因子，同时14-3-3γ和ζ蛋白的表达明显减少，提示14-3-3蛋白在小胶质细胞的免疫炎症反应中也发挥了作用。LPS可以激活小胶质细胞膜表面的酪氨酸激酶使NF-κB活化，并导致炎症因子基因表达。14-3-3蛋白作为接头/支架蛋白可以与100多种蛋白质相互作用，包括各种激酶、受体、支架蛋白等。

　　有资料显示，当星型胶质细胞缺血性损伤时，14-3-3γ蛋白可以由均匀点状分布调节成纤维丝甚至堆积成块状来改变与其结合的蛋白分布〔5〕。LPS激活小胶质细胞后，14-3-3蛋白与酪氨酸激酶结合，可以对炎症因子的释放产生影响。目前，尚不能确定这种改变是起促进还是抑制炎症因子释放的作用。总之，在中枢神经系统的免疫炎症反应中14-3-3蛋白也发挥了作用。

　　【参考文献】

　　1 Kim YS，Joh TH.Microglia，major player in the brain inflammation：their roles in the pathogenesis of Parkinson′s disease〔J〕.Exp Mol Med，2006;38(4)：333-47.

　　2 Aitken A，Baxter H，Dubois T，et al.14-3-3 proteins in cell regulation〔J〕.Biochem Soc Trans，2002;30(1)：351-60.

　　3 Xu J，Kao SY，Lee FJ，et al.Dopamine-dependent neurotoxicity of alpha-synuclein：a mechanism for selective neurodegenration in Parkinson disease〔J〕.Nature Med，2002;8：600-6.

　　4 Berg D，Riess O，Bornemann A.Specification of 14-3-3 protein in Lewy bodies〔J〕.Ann Neurol，2003;54(1):135.

　　5 Chen XQ，Chen J，Zhang Y，et al.14-3-3 gamma is upregulated by in vitro ischemia and binds to protein kinase Raf in primary cultures of astrocytes〔J〕.Glia，2003;42：315-24.