血管性痴呆模型大鼠海马神经元凋亡和病理改变的实验研究

　　作者：罗永坚 蔺心敬 李吕力 杨德刚 王铁建 董艳玲 肖继东 作者单位：广西壮族自治区人民医院神经内科，广西 南宁 530021

　　【摘要】 目的 观察血管性痴呆(VD)模型大鼠海马CA1区神经元凋亡和病理改变，探讨其在VD发病过程中的作用。方法 制备VD大鼠模型，分别在造模后第7、14、21天用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡，用HE染色法检测其病理改变。结果 模型组大鼠海马CA1区可见大量凋亡神经元，14 d时凋亡神经元数量与7 d和21 d比较差异均有统计学意义(P<0.05);而模型组大鼠海马CA1区凋亡神经元数量与正常组和假手术组比较均有统计学意义(P<0.01)。病理检测结果显示：模型组大鼠海马CA1区神经元明显减少、缺血坏死明显。结论 海马CA1区神经元的大量凋亡丢失,可能是患者脑卒中后发生VD的病理基础。

　　【关键词】 血管性痴呆 海马 细胞凋亡 病理

　　血管性痴呆(VD)是由脑血管因素导致脑组织损害引起的痴呆综合征，其确切发病机制尚不明确。海马CA1区是海马结构中与人类学习记忆关系最为密切的功能区,具有对缺血的选择易损伤性〔1〕。近年对细胞凋亡机制研究提示：细胞凋亡可能在VD的发病过程中具有重要作用〔2〕。但有关海马CA1区神经元凋亡在VD发病过程中的动态变化尚未见报道。本研究动态观察了VD大鼠海马CA1区神经元凋亡和病理改变，旨在进一步探讨其在VD发病过程中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 动物来源和分组

　　由重庆医科大学实验动物中心提供，采用高脂喂养的Wistar大鼠，体质量(370±50)g，鼠龄3个月，SPF级，雌雄不拘。将54只大鼠随机分为3组，每组18只：①模型组大鼠制备VD模型，②假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉,③正常组大鼠不作任何处理。于造模后第7、14、21天断头取脑每小组6只。

　　1.2 动物模型制作

　　参考李巍的方法〔3〕并略加改进〔4〕。将大鼠用水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，颈正中部常规消毒后切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣。拉紧丝扣，同时在距尾尖1 cm处剪断放血约1 ml，热凝止血。阻断血流20 min，松开丝扣使血液灌注10 min后，再次阻断血流20 min，第2次再灌注后观察30 min，缝合皮肤，切口局部注射庆大霉素0.2万U。术后肌注青霉素0.2万U/d，连续3 d。

　　1.3 细胞凋亡检测

　　1.3.1 组织标本处理

　　实验终点将动物给予4%多聚甲醛灌注30 min。断头取脑放入4%多聚甲醛后固定后，依次酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、连续冠状切片，片厚5 μm。

　　1.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡，凋亡TUNEL试剂盒购自美国ROSS公司，参照TUNEL试剂盒说明进行。

　　1.3.3 结果观察

　　结果在40倍物镜下观察每张切片TUNEL阳性细胞，用北京天地公司计算机图像分析系统TD2000处理，采集图像输入计算机，以灰度计算所选视野阳性染色的单位面积(阳性细胞的面积占所选整个视野面积的百分比)，每张切片取梗死灶边缘区互不重叠的5个视野，其均值即为该标本每个高倍镜视野中阳性细胞的单位面积。

　　1.4 病理检查

　　于造模后第7、14、21天，在各小组随机取大鼠各一只断头取脑，迅速在大脑中部冠状切取3 mm大脑厚片，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切4 μm切片，HE染色。

　　1.5 统计学处理

　　所有结果均以x±s表示，应用SPSS11.5统计学软件进行t检验及方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠海马CA1区神经元凋亡情况

　　光镜下观察，TUNEL染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，神经元体积缩小，呈三角形或扇形，尼氏小体消失，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质浓集于核周，呈新月形、环形、长条形、块状小体甚至形成核碎片。而阴性神经元的胞核则不显示黄色，神经元形态正常故较易区别。正常组和假手术组大鼠海马CA1区组织中只有零星的凋亡神经元;而模型组大鼠可见大量凋亡神经元，呈大量成簇出现，14 d时凋亡神经元最多(表1,图1～图3)。表1 大鼠海马CA1区神经元凋亡情况(略)

　　2.2 大鼠海马CA1区病理检查结果

　　模型组大鼠的海马神经元有片状的胞浆嗜酸性变，神经元细胞核边界不清，伴有细胞脂肪性变及少许炎性细胞浸润，神经元数量明显减少，缺血坏死明显。而假手术组和正常组大鼠海马组织正常。

　　3 讨 论

　　细胞凋亡的确切机制尚不清楚,可能与凋亡细胞内氧自由基增多、钙超载及兴奋性氨基酸释放〔5〕、以及凋亡细胞内活跃的基因表达有关〔6〕。细胞凋亡是一种重要的生命现象，它不仅出现在生理状态下，更与许多疾病的发生有密切关系。研究表明〔7〕，脑神经元对凋亡损伤极其敏感，在脑卒中的病理过程中存在细胞凋亡这一病理机制。本研究结果表明：模型组大鼠海马CA1区在造模后7 d即出现神经元凋亡，到第14天达高峰，至21 d仍有大量神经元凋亡。同时，本研究病理结果显示：模型组大鼠的海马神经元数量明显减少，缺血坏死明显。海马是与认知功能相关的重要脑区，是学习、记忆的高级中枢，它直接参与信息的贮存和处理。由于海马神经元的存活数量直接影响神经元突触的可塑性效应,从而影响海马对信息的处理和传递。因此，海马CA1区神经元的大量凋亡丢失及缺血坏死可能是患者脑卒中后发生VD的病理基础,是VD发病的重要机制之一。这一结果为临床对脑卒中患者进行早期干预治疗、以减少海马神经元凋亡丢失和缺血坏死，最大限度保护脑功能，以预防脑卒中患者VD的发生提供了可靠的理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Burda J,Matiasova M,Gottlieb M，et al.Evidence for a role of second pathophysiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region〔J〕.Neurochem Res,2005;30(11):1397405.

　　2 Fang M,Li J,Tiu SC,et al.NmethylDaspartate receptor and apoptosis in Alzheimer’s disease and multiinfarct dementia〔J〕.J Neurosci Res,2005;81(2):26974.

　　3 李 巍，张世仪，赵惠敏，等.小鼠脑缺血性学习记忆障碍模型的建立〔J〕.基础医学与临床，1995;15(6)：4469.

　　4 蔺心敬，李吕力，钟维章，等.血管性痴呆大鼠模型的制备与评价〔J〕.中国比较医学杂志，2006;16(12)：7335.

　　5 Chiarugi V，Magnelli L，Cinelli M.Complex interplay among apoptosis factors:RB,p53,E2F,TGFBrta,cell cycle inhibitors and the bcl2 gene family〔J〕.Pharmacol Res,1997;35(4):25761.

　　6 Tsukahara S，Yamamoto S，Shwe TT，et al.Inhalation of lowlevel formaldehyde increases the bcl2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice〔J〕.Neuroimmunomodulation，2006;13(2):638.