石杉碱甲对阿尔茨海默病细胞模型的防护作用

　　作者：程永杰 李红杰 孙肖爽 余 莉 畅美季 徐晓燕 作者单位：(长春市中心医院神经内科，吉林 长春 130051)

　　【摘要】 目的 探讨石杉碱甲对阿尔茨海默病(AD)细胞模型的保护作用。方法 采用20 μmol/L Aβ2535作用于PC12细胞48 h，再应用不同浓度的石杉碱甲(0.1、1、10 μmol/L)预孵育1 h，然后加入20 μmol/L的Aβ共孵育48 h。测定细胞存活率，并计算凋亡细胞百分率。结果 20 μmol/L的Aβ使PC12细胞存活率降至61.73%(P<0.01)，0.1 μmol/L的石杉碱甲可提高细胞存活率至73.12%(P<0.05)，1、10 μmol/L的石杉碱甲显著提高细胞存活率至87.01%、89.31%(P<0.01)。正常PC12细胞凋亡率为2.3%，20 μmol/L Aβ作用PC12细胞后，细胞凋亡率达12.1%，1 μmol/L的石杉碱甲使20 μmol/L Aβ诱导的PC12细胞凋亡率降至4.2%(P<0.05)。结论 石杉碱甲对阿尔茨海默病细胞模型具有明显的保护作用，其作用机制可能为抑制Aβ诱导的细胞凋亡。

　　【关键词】 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;PC12;石杉碱甲;凋亡;神经保护

　　阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是老年人中常见的神经系统退行性疾病，临床表现为进行性认知障碍、行为紊乱和日常生活能力衰退，这些症状与AD患者脑内乙酰胆碱水平降低有关，增加脑内乙酰胆碱水平可显著改善AD症状〔1〕。石杉碱甲是一种新型石松类生物碱有效单体，可选择性结合和抑制皮质和海马的乙酰胆碱酯酶，增加神经细胞突触间隙乙酰胆碱的浓度，改善AD患者的临床症状〔2〕。但目前研究多集中于石杉碱甲的拟胆碱治疗，而关于其抗凋亡、神经防护作用研究较少。本研究旨在探讨石杉碱甲对AD细胞的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 PC12细胞来源于中科院上海细胞库，石杉碱甲(商品名:双益平)购于上海复旦复华药业有限公司(批号：090504)，β淀粉样蛋白(Aβ2535)购于Sigma公司，高糖DMEM培养基和胰蛋白酶为GiBCo公司产品，新生牛血清购于杭州四季青公司，L谷氨酰胺、噻唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、丫啶橙均为Sigma产品，溴化乙啶为Amresco产品。

　　1.2 细胞培养 DMEM培养基中加入10%的新生牛血清、1%L谷氨酰胺、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，pH值调至7.2～7.4。PC12细胞加入37℃、5% CO2孵箱DMEM培养液中培养，2 d更换一次培养液，待细胞长至90%接触时，用0.05%的胰蛋白酶消化细胞，1∶3～1∶4分瓶传代，选取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 细胞活性的测定 取对数生长期PC12细胞，以1×104个细胞、100 μl/孔，接种于96孔培养板，继续于孵箱中培养24 h。 将PC12细胞随机分为对照组和实验组，每组设4个平行孔。对照组采用20 μmol/L Aβ2535作用于PC12细胞48 h;实验组采用不同浓度的石杉碱甲(0.1、1、10 μmol/L)预孵育PC12细胞1 h，然后加入20 μmol/L Aβ继续孵育48 h。每孔加5 mg/ml MTT 10 μl，4 h后弃培养液，加DMSO 100 μl/孔。轻轻震荡10 min，使甲臜颗粒充分溶解，用酶标仪在570nm处测吸光度(OD)值并减去背景OD值。取4孔均值按公式计算细胞存活率。细胞存活率=每组测得的OD均值/正常PC12细胞OD均值×100。每组实验重复4次。

　　1.4 细胞凋亡率检测 石杉碱甲和Aβ作用PC12细胞48 h后，96孔培养板每孔留培养液25 μl，加入丫啶橙和溴化乙啶混合液1 μl，2 min后于倒置荧光显微镜下计数凋亡细胞(共计数300个细胞)。凋亡百分率=凋亡细胞数/细胞总数×100。每组实验重复3次。

　　1.5 统计学处理 OD值及细胞存活率以x±s表示，数据采用t检验和方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 石杉碱甲的防护作用 见表1。20 μmol/L的Aβ使PC12细胞存活率降至61.73%(P<0.01)，1 μmol/L和10 μmol/L石杉碱甲可显著提高细胞存活率至87.01%、89.31%(P<0.01)，表明石杉碱甲具有拮抗Aβ对PC12细胞的毒性作用。表1 不同浓度石杉碱甲对20 μmol/L Aβ引起PC12细胞OD值及细胞存活率改变的影响

　　2.2 石杉碱甲对细胞凋亡的影响 正常PC12细胞的凋亡百分率为2.3%。用20 μmol/L Aβ作用PC12细胞48 h，诱导细胞凋亡的百分数为12.1%。1 μmol/L的石杉碱甲使20 μmol/L Aβ诱导PC12细胞凋亡的百分数下降至4.2%(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)对PC12细胞的损伤已被国际上公认为AD的理想细胞模型，近年研究显示Aβ的神经毒性及其在神经元中的沉积对AD发生和发展起着关键作用，诱导细胞发生凋亡是Aβ细胞毒性作用的重要一环〔3〕。神经元中引起凋亡的决定位点是线粒体，受损伤的线粒体可释放凋亡因子和细胞色素C，通过p53蛋白、Bax2蛋白、Bclxl蛋白参与并激活caspase系统，成为细胞凋亡的重要途径。本研究显示，Aβ2535呈剂量依赖性的毒性作用，提示细胞线粒体氧化还原活性降低〔4〕，使细胞存活率明显下降，导致PC12细胞凋亡。

　　石杉碱甲能够与胆碱酯酶可逆性结合，使胆碱酯酶不能水解乙酰胆碱，从而提高乙酰胆碱水平。有研究显示，石杉碱甲除具有抗乙酰胆碱酯酶的活性外，还能对抗Aβ、过氧化氢、缺血缺氧等诱发的氧化应激、细胞凋亡及对抗一氧化氮、兴奋性氨基酸的毒性等作用〔5〕。此外，石杉碱甲易于透过血脑屏障进入中枢，且可选择性分布在皮质、海马等与学习、记忆有关的神经通路区域，对脑内胆碱酯酶有较高的选择性抑制作用，故其可显著改善AD患者的记忆障碍、认知功能、行为异常、提高日常生活能力等〔5〕。本研究显示，预先给予石杉碱甲可以明显提高细胞存活率，防止细胞凋亡。石杉碱甲的抗凋亡作用可能是通过抑制线粒体释放细胞色素C 、抑制活性氧簇的形成和抑制Caspase3酶的活性，阻碍细胞凋亡来实现的〔6,7〕。因而认为石杉碱甲的作用是多靶点的，可能是通过多种机制相互作用起到神经保护作用。

　　综上，本研究提示，Aβ2535可造成细胞活性下降、线粒体功能紊乱、引起细胞凋亡，石杉碱甲可提高细胞存活率、抗凋亡，从细胞水平上进一步证实了石杉碱甲对AD的神经防护作用。此外，石杉碱甲还具有口服生物利用度高及不良反应少、安全性好等优点〔8〕，故其是具有前途的抗AD药物。

　　【参考文献】

　　1 邝明子，肖卫民，王世芳，等.石杉碱甲改善阿尔茨海默病患者智能障碍的效果评价〔J〕.中国临床康复，2004;8(7)：12167.

　　2 郑 如，苏银法.石杉碱甲的临床应用研究进展〔J〕.实用药物与临床，2008;11(2)：1078.

　　3 Loo DT，Copani A，Pike CJ,et al.Apoptosis is induced by betaamyloid in cultured central nervous system neurons〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1993;90：79515.

　　4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.Immumol Methods，1983;65：5563.

　　5 刘小林，程春荣，曹 威，等.石杉碱甲的药理作用与临床应用研究进展〔J〕.医药导报，2006;25(2)：905.

　　6 Xiao XQ，Zhang H.Huperzine A attenuates amyloid βpeptide fragment 2535 induced apoptosis in rat cortical neurons via inhibiting reactive oxygen species formation and caspase3 activation〔J〕.J Neurosci Res，2002;67:306.

　　7 Zhou J，Tang XC.Huperzine A attenuates apoptosis and mitochondriadependent caspase3 in rat cortical neurons〔J〕.FEBS Lett，2002;526(13)：21.

　　8 张振馨，王新德，陈清棠，等.石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的有效性和安全性的多中心双盲随机对照试验〔J〕.中华医学杂志，2002;82(14)：9414.