膀胱移行细胞癌mP53和PCNA表达的相关性及临床意义
发表时间：2009-09-29 浏览次数：677次
作者：贡冰峰，严春寅，孙 浩，温端改，侯建全，浦金贤，马克钧，潘 鹏 作者单位：苏州大学附属第一医院泌尿外科，江苏苏州 215006
【摘要】 目的 探讨膀胱移行细胞癌(BTCC)突变型P53基因(mP53)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的相关性及临床意义。方法 应用免疫组化二步法，检测50例BTCC组织和10例正常膀胱黏膜中mP53、PCNA的表达，结合临床病理资料进行统计分析。结果 50例BTCC mP53阳性表达率66%，PCNA阳性表达率76%；10例正常膀胱黏膜mP53和PCNA的表达均为阴性(P<0.05)；mP53和PCNA表达呈正相关(r=0.63, P<0.05)；mP53和PCNA阳性表达率在浸润型肿瘤组、G2和G3级肿瘤组、复发组均较高(P均<0.05)。结论 mP53和PCNA在膀胱移行细胞癌中表达均增高，二者与BTCC分期、细胞的分级、复发相关，可作为判断BTCC预后的参考指标。
【关键词】 膀胱移行细胞癌；突变型P53基因；增殖细胞核抗原； 免疫组化
突变型P53基因(mutant P53, mP53)与肿瘤的发生关系密切，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是目前较为肯定的核增殖标志基因。我们检测了10例正常膀胱黏膜、50例膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder, BTCC)组织中mP53、PCNA的表达并结合临床病理资料进行分析和评价。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料 选择我院泌尿外科1997年12月-2001年3月临床资料完整且石蜡标本能满足实验研究的病例共50例，均为原发性膀胱移行细胞癌，行膀胱部分切除术。男性46例、女性4例，年龄24-81岁，平均58.4岁。临床分期按UICCTNM标准：表浅性18例、浸润性32例。病理分级按WHO标准：G1 13例、G2 19例、G3 18例。肿瘤数目：单发31例，2个及多发19例。随访2-3年，复发26例。10例正常膀胱黏膜取自前列腺增生症行开放手术的患者。
1.2 材料 鼠抗人P53蛋白单克隆抗体工作液，鼠抗人PCNA单克隆抗体工作液，DAKO Envision系统，DAB+显色剂均购自上海基因公司。
1.3 方法 载玻片事先经多聚L赖氨酸(PolyLLysine)防脱片处理，蜡块切片厚3μm，采用二步法免疫组化染色(immunohistochemistry, IHC)。mP53蛋白、PCNA定位于细胞胞核， mP53、PCNA以细胞核呈清晰棕黄色颗粒判断染色为阳性。参考Volm Metal的评判标准[1]，以随意5个400倍视野的癌巢区阳性细胞所占比率的平均数分为，阴性(-)：阳性细胞数<10%；弱阳性(+)：阳性细胞数10%-25%；阳性()：阳性细胞数26%-50%；强阳性()：阳性细胞数>50%。
1.4 统计学处理 使用SAS 6.12统计软件进行统计分析，采用χ2检验和Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果
10例正常膀胱黏膜mP53和PCNA的表达均为阴性，50例BTCC mP53阳性表达率66%，PCNA阳性表达率76%。在浸润型肿瘤组、高级别(G2和G3)肿瘤组、肿瘤复发组mP53和PCNA阳性表达率均较浅表型肿瘤组、低级别(G1)肿瘤组、肿瘤未复发组增高(P均<0.05)；mP53、PCNA表达与患者年龄和肿瘤数目无关(P均>0.05，表1)。mP53和PCNA表达呈正相关(spearman等级相关系数rs=0.63，P<0.05，表2)。表1 mP53、PCNA表达与BTCC临床参数的关系[n=50, n(%)]
3 讨 论
膀胱癌是泌尿系常见恶性肿瘤，以BTCC多见，手术切除后容易复发，通常认为BTCC的复发与肿瘤病理分级和浸润深度有关。据此，制定了一系列的“标准”手术方案，试图“彻底”切除癌肿，但癌肿切除后复发率仍较高，可高达50%-70%，传统判断预后的方法及治疗方案有待进一步完善。事实上，BTCC复发常不在原来部位，并非全由手术不彻底引起，实属新生肿瘤。Heer[2]对148例Ta期膀胱癌患者进行长达15年的随访，发现随着复发次数的增多，膀胱癌的浸润深度也增加。寻找理想的膀胱癌生物学行为标志物，采取积极有效的治疗方案，减少复发，延缓病情的发展显得尤为重要。
P53基因是与人类肿瘤相关性最高的基因之一，定位于染色体17p13.1，长约20kb，含有11个外显子，10个内含子，有野生型(wild type)和突变型(mutant type)之分。野生型P53(wP53)基因为抑癌基因，其表达产物wP53蛋白是一种DNA结合磷蛋白，具有与双链或单链DNA结合的能力，含有393个氨基酸残基，分子质量约50ku，位于细胞核内，其N端73个氨基酸为调控活性区，它的表达及磷酸化与细胞周期有关，主要是抑制细胞从G1期进入S期，对细胞周期起负调节作用。突变型P53(mP53)基因为癌基因，其表达产物mP53蛋白不具备wP53蛋白的功能。mP53蛋白半衰期为2-12h，可用免疫组化的方法检测到；wP53蛋白半衰期为20-60min，含量非常低，用免疫组化的方法无法检测到[3]。mP53蛋白较wP53蛋白更稳定，其表达水平更高，mP53蛋白在细胞内高水平积累，又使wP53蛋白不能行使正常功能，客观上造成wP53基因失活 [4]。徐晔等[5]研究发现：mP53蛋白与BTCC 微血管密度成正相关，能促进微血管生成，从而为膀胱癌的恶性增殖提供营养条件。
PCNA基因是目前较为肯定的核增殖标志基因，定位于染色体20p12，长约12kb，mRNAPCNA有两种变异体，分别含1355bp和1319bp。PCNA是一种细胞周期调控蛋白，定位于细胞核，由261个氨基酸组成，分子质量36ku；是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，DNA合成必不可少的因子。PCNA在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关，在静止期细胞内其含量很低，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降。Elkott等[6]研究发现，PCNA能独立预测膀胱癌患者的5年生存情况。
本研究表明，在BTCC中mP53和PCNA表达呈正相关，二者均与肿瘤的浸润性、细胞低分化、复发等恶性生物学行为密切相关。因此，mP53和PCNA是膀胱癌恶性生物学行为的标志物，可作为判断BTCC预后的参考指标。对mP53和PCNA表达均阳性的患者，不但要在术中彻底切除肿瘤组织，还要在术后加强膀胱灌注化疗，密切随访，及时处理复发病灶。近年来，小RNA干扰技术的应用，为基因功能的研究开辟了新的途径。Merkerova等[7]在研究BCR/ABL阳性的慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)时发现，利用小RNA干扰技术，使PCNA基因转录后沉默，可以上调p21、p19INK4D，proapoptotic FAST kinase，fibronectin等基因的表达，下调CDK1，CDK4，PLK1，ERK3，JNK1，STAT5，DAXX，Mdm2，survivin等基因的表达。Kim等[8]利用小RNA干扰技术研究证实，wP53基因对膀胱黏膜上皮细胞周期有负调控作用，wP53基因的表达能抑制膀胱黏膜上皮的增生[8]。利用小RNA干扰技术可以进一步研究PCNA基因和mP53基因的功能，靶向PCNA基因和mP53基因的小RNA干扰技术用于治疗BTCC和预防BTCC复发值得深入研究。
【参考文献】[1]Toi M, Hoshina S, Takayanagi T, et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapce in primary breast cancer [J]. Jpn J Cancer Res, 1994, 85:10451049.
[2]Heer HW. Tumor progression and survival of patients with high grade,noninvasive papillary (TaG3) bladder tumors:15year outcome [J]. J Urol, 2000, 163:6062.
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[4]王琳芳，杨克恭. 医学分子生物学原理 [M]. 北京:高等教育出版社，2001:792795.
[5]徐晔，贡冰峰，范炜，等. 膀胱尿路上皮癌突变型P53表达和微血管密度测定的意义 [J]. 医学研究生报, 2006, 19(4):356358.
[6]Elkott AF, Elbaz MA, Mokhtar AA. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) overexpression and microvessel density predict survival in the urinary bladder carcinoma [J]. Int Urol Nephrol, 2006, 38(2):237242.
[7]Merkerova M, Bruchova H, Brdicka R. Expression analysis of PCNA gene in chronic myelogenous leukemiacombined application of siRNA silencing and expression arrays [J]. Leuk Res, 2007, 31(5):661672.
[8]Kim J, Keay SK, Dimitrakov JD, et al. p53 mediates interstitial cystitis antiproliferative factor (APF)induced growth inhibition of human urothelial cells [J]. FEBS Lett, 2007, 581:37953799.
