PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响作者：张建华，程 跃    作者单位：宁波市第一医院泌尿外科，宁波 315010    【摘要】  目的 研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的作用。方法 将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBpPTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBpPTEN体外转染BIU87细胞(pBpPTENBIU87)，筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU87细胞(pBpBIU87)和正常BIU87细胞为对照,用RTPCR检测PTEN的表达情况。将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU87(pBpPTENBIU87)，以BIU87细胞和pBpBIU87细胞为对照，应用Wester blot方法检测三组细胞P110(PI3K的催化亚单位)、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况。结果 3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化，但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组。结论 PTEN是通过对PI3KAkt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成。PTENPI3KAkt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制。    【关键词】  膀胱癌；PTEN；三磷酸酰肌醇激酶；Akt    PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，它通过发挥磷酸酶作用，降低多种信号传导途径的关键酶的磷酸化水平，阻断信号传导通路，以抑制细胞的生长、黏附、铺展和迁移，诱导凋亡，从而对肿瘤的生长、侵袭和转移产生负性调节作用。PI3KAkt途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号转导通路，细胞外信号分子通过磷酸化依次激活三磷酸酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B (Akt/PKB)及其他下游信号分子，以促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细胞周期起正调控作用，导致细胞恶性转化。本实验检测PTEN基因转染前后膀胱癌细胞P110(PI3K的催化亚单位)、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表达情况，以期证明PTEN可能通过PI3KAkt信号传导途径起抑癌作用。1  材料与方法    1.1  主要材料和试剂  人膀胱癌细胞系BIU87从武汉同济医院妇科肿瘤实验室引入，pBpPTEN及pBabepuro(pBp)空质粒由武汉同济医院骨科冯尔宥博士惠赠，DH5α大肠杆菌菌株来自武汉同济医学院生化教研室。Trizol和大量质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)、限制性内切酶EcoRⅠ(宝生物工程大连有限公司)、脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)、PCR引物(上海赛百盛公司)、通用RTPCR试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限公司)    1.2  细菌的转化和扩增培养  氯化钙法制备感受态大肠杆菌DH5α。于EP管中加入质粒和感受态DH5α，混匀后至水浴中热休克，再加入无抗生素LB培养基孵育。从EP管中取菌液，接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养过夜。挑取单个菌落，转入含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇过夜至饱和生长，-70℃冰箱保存。    1.3  质粒的抽提纯化和酶切鉴定  取质粒转化的菌液到含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇过夜。按大量质粒抽提纯化试剂盒说明书的步骤，提取并纯化pBpPTEN或pBp。将纯化的质粒DNA，于紫外分光光度计上检测纯度，A260/A280=1.8-2符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切DNA片段。    1.4  基因转染和细胞筛选  在6孔板中接种BIU87细胞，培养至满70%-80%，按脂质体Lipofectamine 2000说明书的步骤，将pBpPTEN或空质粒pBp导入BIU87细胞，转染24h后换液，并于荧光显微镜下观察，继续培养48h，加嘌呤霉素筛选并扩增培养。    1.5  RTPCR  提取细胞RNA后，按通用RTPCR试剂盒步骤进行操作。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，循环32周，72℃再延伸8min。PTEN的上游引物为5′TTTGTGGTCTGCCAGCTA3′，下游引物为5′GGTTCATTCTCTGGATCAGA3′， 扩增片段为510bp。βactin作内参照，其上游引物为5′CCGACAGGATGCAGAAGGAGAT3′，下游引物为5′GTCAAGAAAGGGTGTAACGCAACT3′，扩增片段为238bp。将pBpPTEN转染细胞(pBpPTENBIU87)、pBp转染细胞(pBpBIU87)和未转染细胞(BIU87)的PCR产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶分析系统观察。    1.6  Western blot  制作凝胶(SDS聚丙烯酰胺凝胶)后，凝胶板安置于电泳槽，将处理好的样品加入槽内。电泳后取出凝胶，进行半干式电转移，胶中的蛋白质将转移至膜上。最后行免疫显色。膜置滤纸上干燥，分析结果。2  结    果    质粒鉴定证实含有PTEN基因(图1)，RTPCR证实PTEN转染后稳定表达(图2)。三种细胞P110和Akt的Western blot阳性条带强度相似，提示转染前后P110和Akt蛋白的总水平无明显变化；PTEN转染后，磷酸化P110和磷酸化Akt的阳性条带明显较对照组弱，说明PTEN转染导致P110和Akt的磷酸化水平降低(图3)。3  讨    论    PTEN又称MMAC1或TEP1，是1997年克隆到的一种新的肿瘤抑制基因，定位于人类染色体10q23，有9个外显子和8个内含子，PTEN的cDNA包含一由1209个核苷酸组成的开放阅读框，其翻译的蛋白由403个氨基酸组成，是一种磷酸酶[1]。PTEN蛋白具有与蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化中心同源的序列，同时还具有脂质磷酸酶作用，故同时具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶，称之为双重特异性磷酸酶[2]。现已发现在多种类型的原发性恶性肿瘤和各种肿瘤细胞株中PTEN存在有较高频率的缺失或突变，出现表达缺失，如胶质细胞瘤、Cowden综合征、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌等。研究发现，PTEN的表达缺失与这些肿瘤的进程和预后相关，然而PTEN的作用途径至今并未完全清楚。    PI3KAkt途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号转导通路[34]。细胞外信号分子如生长因子结合受体后磷酸化PI3K，活化后的PI3K通过对膜脂质和PIP2的磷酸化反应产生PIP3，PIP3是细胞生长调控中重要的信号分子，它结合Akt并使之定位于胞膜，Akt发生构象改变，易于被磷酸化激活。Akt是一种高度保守的蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶，被认为是原癌基因之一，通过对凋亡调控蛋白的磷酸化而抑制细胞的凋亡。活化的Akt作用于其下游底物，促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细胞周期起正调控作用。    本实验用脂质体转染的方法将外源性PTEN导入人膀胱癌细胞系BIU87，RTPCR证实其在BIU87中稳定表达。应用Western blot方法,以未转染细胞和空质粒转染细胞为对照，检测PTEN阳性、稳定转染的细胞克隆中P110、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表达情况。结果证实转染PTEN后，P110和Akt总蛋白表达水平无变化，而磷酸化P110和磷酸化Akt的表达水平明显降低。这说明PTEN通过它的脂质磷酸酶作用降低了PI3K和Akt的磷酸化水平，阻断PI3KAkt路径，抑制Akt及其下游激酶的活性，抑制细胞增殖，促进细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展，也就是说PTEN是通过对PI3KAkt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤形成的。Tonks等[5]发现，每种保持PTEN蛋白功能丧失的突变都同时丧失了脂质磷酸酶活性，但其蛋白磷酸酶活性仍表达。这一发现表明脂质磷酸酶活性对于抑制细胞生长起着关键作用，而PTENPI3KAkt通路是脂质磷酸酶作用的最重要途径，因此，可以说PTENPI3KAkt通路是PTEN的主要作用机制。    PTEN可能通过对PI3KAkt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成，这是对肿瘤抑制的新见解。然而人们对PTEN作用及机制的认识还处于初步阶段，PTEN的具体作用底物及其相互之间的关系，PTEN的表达与肿瘤分期分级的关系及对临床预后影响等尚有待进一步研究。考虑到在人类肿瘤中此类突变的高发频率，直接针对这一途径组分的新药或现行药会有治疗上的巨大优势。【参考文献】[1]Wu X, Obata T, Khan Q, et al. The phosphatidylinositol3 kinase pathway regulates bladder cancer cell invasion [J]. BJU Int, 2004, 93(1):143150.[2]Janas ML, Hodson D, Stamataki Z, et al. The effect of deleting p110 {delta} on the phenotype and function of PTENdeficient B cells [J]. J Immunol, 2008, 180(2):739746.[3]Castellino RC, Durden DL. Mechanisms of disease: the PI3KAktPTEN signaling nodean intercept point for the control of angiogenesis in brain tumors [J]. Nat Clin Pract Neurol, 2007, 3(12):682693.[4]Zhang X, Jin B, Huang C. The PI3K/Akt pathway and its downstream transcriptional factors as targets for chemoprevention [J]. Curr Cancer Drug Targets, 2007, 7(4):305316.[5]Tonks NK, Myers MP. Structural assets of a tumor suppressor [J]. Science, 1999, 286(5447):20962097.